[发明专利]基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测法

权利要求书

1.一种基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、制备链霉亲和素标记的纳米金；

S2、对样品进行采集、增菌后，提取DNA；

S3、以所述DNA为扩增模板进行环介导等温扩增；

S4、取所述链霉亲和素标记的纳米金加入步骤S3扩增完成的反应溶液体系，反应后观察反应体系溶液；如反应体系溶液产生明显的由红向蓝的变化过程，则代表样品中检测出了副溶血性弧菌，如反应体系溶液未发生由红向蓝的变色过程，则代表样品中无副溶血性弧菌。

2.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，步骤S1中，链霉亲和素标记的纳米金的制备包括如下步骤：

A1、调节纳米金溶液在450nm处的吸光度值在1.5-2.0；

A2、以0.1mol/L的K₂CO₃或0.1mol/L的HCl溶液将纳米金溶液调节至pH＝7～8。

A3、将链霉亲和素稀释成一系列5～40μg/mL溶液，每1mL的纳米金溶液中分别加入0.1mL，混匀静置后，加入0.1mL10％的NaCl溶液，混匀静置，随着链霉亲和素的用量的增加，纳米金溶液由蓝色变为红色；选择由蓝色变为红色的链霉亲和素用量1.1倍作为最佳蛋白标记比例；

A4、每10mL的经步骤A1和A2调节好的纳米金溶液中，加入所述最佳蛋白标记比例的链霉亲和素溶液，混匀后加入0.1mL 10％PEG20000溶液再次混匀；

A5、离心分离后，将底层悬浮液用0.5mg/mL PEG20000溶液重新离心沉淀，恢复后加入0.1mg/mL叠氮化钠后冷藏保存待用。

3.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述提取包括：将过夜培养的增菌液混匀后静置，吸取菌悬液每5mL，加入无菌离心管中，以8000～12000r/min离心，弃去上清液，加入0.5～2mL TZ裂解液悬浮菌体。

4.根据权利要求3所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，所述TZ裂解液的配制包括：2.0％Triton X-100，2.5mg/mL的叠氮化钠，0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0；沸水浴10min，置冰上10min，然后10000r/min离心5min，冷冻保存待用。

5.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，所述环介导等温扩增中采用的针对副溶血性弧菌的tlh基因的特异性标记引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示；采用的针对副溶血性弧菌的tlh基因的探针的序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

6.根据权利要求5所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，所述环介导等温扩增体系总体积为40μL，除所述引物和探针序列外，还包括如下试剂：各2.0μmol/L的FIP和BIP，各0.3μmol/L的F3和B3，1μmol/L LF和LB，1×20mM、pH8.8的Tris-HCl恒温缓冲液，1.2mol/L的甜菜碱，7mmol/L的MgSO₄，2.0mmol/L的dNTP，5U/μL的Bst大片断DNA聚合酶和2μLDNA模板。

7.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，步骤S3还包括，以副溶血性弧菌的tlh基因标准DNA模板作为阳性模板对照，以无菌水作为阴性模板对照同时进行所述环介导等温扩增。

8.根据权利要求1所述的基于纳米金变色响应等温核酸扩增的副溶血性弧菌检测方法，其特征在于，步骤S4中，每20～100μL步骤S3扩增完成的反应溶液体系中加入的所述链霉亲和素标记的纳米金为10～50μL。