[发明专利]用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法

说明书

本发明公开了一种用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法，包括下列步骤：（1）菌株的鉴定和培养基；（2）同位素标记和冷激过程；（3）样品制备。本发明利用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌，同位素内标与其他非标记或化学方法相比，最大的好处就是：最大限度的降低了因试剂、操作、纯度等等一系列在实验中无法避免的负面影响所造成的误差，尤其是在蛋白质操作过程中，由于是直接将N15和N14混合成一个样品来分析，成为一个整体的体系，最大限度的减小了双体系分析所造成的误差。

技术领域

本发明涉及一种用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法。

背景技术

副溶血弧菌是水产品加工、运输、贮藏等各个环节中极易感染的食源性致病菌，其致病性可以引起人类急性肠道疾病，并大规模扩散，危害极大。尤其是在生食或半生食海鲜类，例如牡蛎、生鱼片等风险会更高。而且副溶血弧菌在低温状态下，菌体的一些理化性质、致病性和抗逆性都有不同程度的提高(例如4℃下，其抗过氧化物、双氧水、抗紫外线、抗化学试剂、以及低温适应性能力都有提高，主要依赖于对低温环境下，菌体自身的蛋白质组的具体变化的定量分析发现后推出以上结论)副溶血弧菌的危害之前只是用一些常规的菌落培养和生化手段进行评价，以鉴定的方式论证比较多，但是一直无法从根本上进行科学的定量。

此次应用同位素方式作为内标物(内参照物)对处于常温下和4℃下，两个星期的由牡蛎中分离的副溶血弧菌进行蛋白质组的分析，因为4℃是海产品加工中常用的温度，也是家用冰箱冷藏室的温度。选两个星期是由于一般来说这是水产品的货架期也是一般老百姓购买食物后放入冰箱平均冷藏期。具有一定的代表性。

同样的菌株分别选用带同位素内标15N培养基对菌进行培养和普通的14N培养基培养，这两种培养基唯一的不同仅仅是N的同位素标记不同，其余成分完全一样，培养几代后，被15N培养基标记的培养基培养的菌体，体内自动携带15N，然后与14N培养基培养的菌一比一混合提取蛋白质组，然后烷基化用胰蛋白酶进行切割，通过LC-nano或RP-HPLC进行分离梳理后，用质谱MS进行最终鉴定和定量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：本发明提供一种用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供的用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法，包括下列步骤：

(1)菌株的鉴定和培养基

分离得到的副溶血性弧菌，经VITEK 2 Compact的GN卡系统或者其他微生物鉴定仪鉴定，可信度要达到95％以上；

(2)同位素标记和冷激过程

菌株纯培养物经生理盐水稀释后，划线接种胰蛋白胨酵母抽提物大豆琼脂平板(TSA-YE，Difco)，37℃培养24小时；然后取两个菌落，分别接种¹⁴N和¹⁵N培养基，接种¹⁴N的培养基在4℃条件下培养2周作为实验测试菌株(这样做的原因是这种条件更接近于日常食物冷藏的温度条件和保鲜时间)，另一个菌落接种在¹⁵N培养基中37度培养12小时，然后可以在同样条件下再转接一到两次，目的是让¹⁵N更加充分地对菌株进行¹⁵N标记。¹⁵N标记的菌作为实验质控菌株，原因是¹⁵N培养基价格比相同的¹⁴N培养基价格要贵，然后将标记好的菌放在-80℃超低温环境，等待2周后与¹⁴N同时进行蛋白质组分析实验。

(3)样品制备

首先对分别用¹⁵N和¹⁴N培养的菌株培养物分别进行OD定量，定量值是OD₆₀₀＝0.4。