[发明专利]用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法

权利要求书

1.用内标法蛋白质组量化测定水产品中副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）菌株的鉴定和培养基

分离得到的副溶血弧菌，经鉴定，可信度达到95%以上；

（2）同位素标记和冷激过程

菌株纯培养物经生理盐水稀释后，划线接种胰蛋白胨酵母抽提物大豆琼脂平板TSA-YE，37℃培养24小时；然后取两个菌落，分别接种¹⁴N和¹⁵N培养基，接种¹⁴N的培养基在4℃条件下培养2周作为实验测试菌株；另一个菌落接种在¹⁵N培养基中37℃培养12小时，然后在同样条件下再转接一到两次；

¹⁵N标记的菌作为实验质控菌株，然后将标记好的菌放在-80℃超低温环境，等待2周后与¹⁴N同时进行蛋白质组分析；

（3）样品制备

首先对分别用¹⁵N和¹⁴N培养的菌株培养物分别进行OD定量，定量值是OD₆₀₀=0.4；

取¹⁵N和¹⁴N菌株培养物各0.3mL，加入50 mmol/L的Tris/HCl，其pH = 7.4；然后12000转5分钟离心，弃上清后置于冰上，然后在4℃下，用间歇超声震荡2分钟，然后12000转离心20分钟，弃上清得蛋白质组；

然后取¹⁵N和¹⁴N蛋白质组各5μg，按一比一混合，得总量10μg蛋白质组样品，用5mM的碘乙酰胺进行烷基化处理，然后用蛋白酶进行酶切，经反相 高效液相色谱进行分离后-20℃保存；

反相高效液相色谱条件如下：

流动相A：0.1 % v/v的甲酸水溶液；

流动相B：0.1 %v/v 的甲酸乙腈溶液；

梯度洗脱：

时间min	持续时间min	%B
0	0	3
15:00	15	8
16:00	1	8
51:00	35	18
66:00	15	28
67:00	1	95
75:00	8	95

流速：400nL/min

质谱条件：

此次质谱选用Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany；

scan range: 375-1,300 Da Top-50；

MSl resolution: 60,000 Positive mode ；

Collision energy : 35 CID；

步骤（3）样品制备中，所述蛋白酶与所述蛋白质组总量的比值是1:50；

所述蛋白酶选择的是胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的组合，两者的重量比例是3:1。