[发明专利]一种在真核细胞中表达固氮酶基因的方法

说明书

本发明涉及一种在真核细胞中表达固氮酶基因的方法，属于基因工程技术领域。该在真核细胞中表达固氮酶基因的方法，包括以下步骤:步骤一：扩增所述固氮酶基因片段；步骤二，构建重组载体：将所述固氮酶基因片段连接至病毒转化载体；步骤三：用步骤二构建的重组载体转染所述真核细胞；步骤四：筛选表达所述固氮酶基因的植物细胞。本发明实现了固氮酶基因在植物中的表达，从而为植物自主固氮奠定基础。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种在真核细胞中表达固氮酶基因的方法。

背景技术

氮肥的使用与我国粮食、能源、环境等可持续发展重大问题的矛盾日益尖锐，生物固氮是全球植物所需氮素的主要来源，约占 75%，利用生物固氮，可减少氮肥的使用，是解决该矛盾的重要措施之一。然而，迄今为止没有发现任何具有固氮功能的真核生物，已知的能够固氮的生物只限于原核微生物，如细菌和放线菌。生物固氮是指固氮微生物利用其自身的固氮酶进行固氮反应的生物过程。固氮酶是将空气中的氮气还原的催化反应中心，是一种复杂的多蛋白复合体，至今仅在原核生物中发现，没有在植物中发现固氮酶基因的报道，也没有发现任何具有自主固氮能力的植物。因此开展固氮基因在植物中的表达研究，达到提高生物固氮效率、扩大宿主范围，发挥生物固氮在农业生产中的作用，将确保我国的主要农作物生产在继续提高产量、改良品质同时，大幅度地减少化肥、农药的施用量，实现我国农业可持续发展。

固氮生物的固氮反应是在固氮酶的催化作用下实现的。固氮酶非常保守，由nif基因组编码。多数固氮生物中的nif基因组包括 16-19个基因，总长度为23kb，其中包括 8 个必需基因：nifHDKENXBQ。典型的固氮酶由铁蛋白和钼铁蛋白两部分组成，通过铁氧化还原蛋白和黄素氧还蛋白等电子供体还原铁蛋白，将单电子从铁蛋白转移到钼铁蛋白(要依赖MgATP水解)，最后电子在MoFe蛋白内部从P簇转移到FeMo簇底物结合位点。每一次电子转移都要求铁蛋白与钼铁蛋白组成一个复合体，转移结束后两个组分再分开。目前所有的固氮生物均有一个钼-铁固氮酶系统，在钼缺少的条件下，一些固氮生物会诱导其它辅助因子固氮酶的合成，如钒-铁或铁-铁辅因子固氮酶。固氮酶对氧敏感，有人推测这是由于该二聚物的两个结构域之间4FE-4S簇的表面暴露所导致的。

固氮酶的固氮反应具有以下基本特点：1、需要金属离子和ATP；2、对氧敏感，需要在无氧或低氧条件下才能发挥作用。正是由于固氮酶的以上特点，迄今为止发现的所有固氮生物只限于原核微生物（细菌和放线菌），这些生物的共同特点是厌氧，除了一个特例——蓝细菌。蓝细菌是一类放氧性光合生物，在光下，会因光合作用放出的氧而使细胞内氧浓度增高，但同时它又有厌氧的固氮系统，它在长期进化过程中形成两种独特的抗氧机制。

1）分化出特殊的还原性异形胞。某些丝状蓝细菌可在细胞链的中间或末端形成异形胞，体积大且有较厚外膜，可防止氧气进入细胞，此外异形胞只有光合系统Ⅰ，因而光合作用不放氧，因此固氮酶在异形胞中可以很好地发挥固氮作用；

2）非异形胞蓝细菌固氮酶的保护多种多样：有的采用将固氮作用与光合作用进行时间上的分隔，黑暗下固氮，光照下进行光合作用，如织线蓝菌属等；有的则形成束状群体，在其中央处于厌氧环境下的细胞失去光合系统Ⅱ，有利于固氮酶在微氧环境下进行固氮作用，如束毛蓝菌属；有的则在固氮酶活性高时，细胞内用以除去有毒过氧化物的过氧化物酶和超过氧化物酶的活力也均提高，如粘球蓝菌属。Lucas J等1985将不产生异型胞的蓝藻Oscilla-toriasp.，无氮培养基上培养，设置不同的光暗循环，结果在黑暗时间超过8小时条件下，只在黑暗时段固氮；如果黑暗时间少于8小时，固氮酶活性在黑暗开始之前就已经有显示。即使是产生异型胞的蓝藻，营养细胞在缺氧的条件下也可以诱导固氮酶，引发固氮反应。这也说明固氮反应不仅局限于厌氧细胞中，确切地说这应该是一个产氧细胞中的固氮需求与高浓度氧反馈抑制的平衡问题。