[发明专利]一种基于核酸适配体的双荧光探针的制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针及其制备方法和应用。该探针的制备过程是，先在硅纳米微球表面修饰与不同靶标分析物的核酸适配体碱基序列互补的两种DNA单链，并在两种核酸适配体链的5’端修饰两种不同的荧光基团，然后将两者混合孵育，基于碱基互补配对的原理，得到双荧光探针。当该探针与靶标分析物共存时，靶标分析物会与核酸适配体竞争结合，从而使核酸适配体与其互补链解链并从探针上脱离下来。将溶液高速离心后，收集上清液并测定荧光强度值，根据两个最大波长处的荧光强度值计算得到各靶标分析物的浓度。本发明所述双荧光探针可实现复杂样品中两种靶标分析物的同时识别及检测，且操作简便、速度快、灵敏度高。

技术领域

本发明涉及一种基于核酸适配体的双荧光探针及其制备方法和应用，具体涉及一种同时实现两种靶标分析物高灵敏度检测的双荧光探针的制备方法。

背景技术

生物传感技术作为分析化学学科中的新型分析技术，具有灵敏度高、专一性好、准确度高、成本低廉、分析速度快以及易于自动化监测等优点，广泛的应用于生命科学，生物医学，食品等领域。

纳米硅材料(Silica Materials for Medical Application, Open Biomed Eng J. 2008; 2: 1–9.)具有高的比表面积和大的孔容，且表面易化学修饰，因此在生物医学领域的应用价值越来越受到人们的重视。

核酸适配体是由20~60个碱基所组成的、能够特异性识别目标分析物的RNA或单链DNA片段(Aptamer-based fluorescent biosensors, Curr Med Chem. 2011;18:4175-4184. )，可在体外通过指数级富集配体系统进化技术筛选出来，具有可与特异的目标分析物（如：凝血酶，溶菌酶，ATP等）高效、专一结合等特点，并易于修饰和功能化。近年来被广泛应用于传感探针的制备，实现生物样品高灵敏度、高选择性传感与识别领域（DNA-Templated Aptamer Probe for Identification of Target Proteins. Anal Chem. 2017; 89(7):4071-4076.）。提高探针对复杂样品中多种目标分析物的高灵敏度识别与检测，可以显著降低检测成本，提高检测效率，对于环境污染监测、临床医学等领域具有重要的意义。

发明内容

针对复杂样品中多种目标分析物同时检测所存在的困难，本发明旨在提供一种基于核酸适配体的双荧光探针，可同时检测两种靶标分析物，该探针的特异选择性好、检测灵敏度高、检出限低。本发明还提供了该双荧光探针的制备方法和应用。

本发明提供了一种基于硅纳米微球和核酸适配体的双荧光探针的制备方法，在该双荧光探针的制备过程中，先在溶菌酶和凝血酶各自的核酸适配体链的5’端分别修饰不同的荧光基团CdTe QDs（λ_em=545nm）及染料Cy5（λ_em=660nm），然后在硅纳米微球表面修饰与两种核酸适配体的碱基序列互补的两种DNA单链，再将修饰有荧光基团的核酸适配体溶液与硅纳米微球溶液混合，由于碱基互补配对，即形成基于硅纳米微球及核酸适配体的双荧光探针。

上述制备方法，具体包括以下步骤：

①硅纳米微球的制备：将20~50μL的四乙氧基硅烷溶于10~20mL的乙醇中，在2000~3000rpm转速的搅拌下，依次加入水10~20 mL、乙醇5~10 mL、氢氧化胺0.2~0.4 mL的混合溶液，混合物室温搅拌2小时，所得纳米微球溶液用乙醇和水离心超声洗涤；所得沉淀中加入溶有10~30μL的 3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液5~10mL，混合物室温继续反应4小时，所得硅纳米微球用乙醇离心洗涤后40℃烘干24h；