[发明专利]一种基于核酸适配体的双荧光探针的制备方法和应用

权利要求书

1.一种基于核酸适配体的双荧光探针的制备方法，其特征在于：在该双荧光探针的制备过程中，先在溶菌酶的核酸适配体链的5’端修饰荧光基团CdTe QDs，在凝血酶的核酸适配体链的5’端修饰染料Cy5，然后在硅纳米微球表面修饰与两种核酸适配体的碱基序列互补的两种DNA单链，再将修饰有荧光基团的核酸适配体溶液与硅纳米微球溶液混合，由于碱基互补配对，即形成基于硅纳米微球及核酸适配体的双荧光探针。

2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的双荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

①硅纳米微球的制备：将四乙氧基硅烷溶于乙醇中，在剧烈搅拌下，逐滴加入水、乙醇、氢氧化胺的混合溶液，经室温搅拌后，所得纳米微球溶液用乙醇和水离心超声洗涤；所得沉淀中加入溶有3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，混合物室温继续反应，所得硅纳米微球用乙醇离心洗涤；

②将两种不同靶标分析物的核酸适配体互补DNA链修饰到硅纳米微球表面：将上述洗涤后的硅纳米微球溶于硼酸缓冲液和NaCl的混合液中，先加入3’端修饰有羧基的凝血酶核酸适配体互补的DNA单链，混合溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺溶液，反应30-50min后，高速离心，取上层清液测定紫外吸光度值，根据互补DNA单链的原始吸光度值及离心后上清液的吸光度值，计算出与凝血酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；再向上述硅纳米微球溶液中加入3’端修饰有羧基的溶菌酶适配体互补DNA单链，混合溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺溶液，反应30-50min后，高速离心15min，取上层清液测定紫外吸光度值，计算出与溶菌酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；最后将该修饰有凝血酶及溶菌酶的核酸适配体互补DNA单链的硅纳米微球，用硼酸缓冲液和二次水洗涤后，重新溶于二次水中待用；

③基于核酸适配体的双荧光纳米微球的制备：固定有两种核酸适配体互补DNA单链的硅纳米微球溶解于杂化缓冲液中，先加入5’端修饰Cy5的凝血酶适配体，在室温下振荡反应后，再加入链端修饰QDs的溶菌酶适配体，在室温下振荡反应，离心后，取沉淀重新溶于水，即得基于硅球与核酸适配体的双荧光纳米微球。

3.根据权利要求2所述的基于核酸适配体的双荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

①硅纳米微球的制备：将20~50μL的四乙氧基硅烷溶于10~20mL的乙醇中，在2000~3000rpm转速的搅拌下，依次加入水10~20 mL、乙醇5~10 mL、氢氧化胺0.2~0.4 mL的混合溶液，混合物室温搅拌2小时，所得纳米微球溶液用乙醇和水离心超声洗涤；所得沉淀中加入溶有10~30μL的 3-氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液5~10mL，混合物室温继续反应4小时，所得硅纳米微球用乙醇离心洗涤后40℃烘干24h；

②将两种不同靶标分析物的核酸适配体互补DNA单链修饰在硅纳米微球表面：将上述洗涤后的硅纳米微球溶于硼酸缓冲液和NaCl的混合液中，得到浓度为30-50mg/mL的硅纳米微球溶液；

先加入3’端修饰有羧基的凝血酶的核酸适配体互补的DNA单链10~50μL，混合溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺溶液20~100μL，反应30-50min后，高速离心，取上层清液测定紫外吸光度值，根据互补DNA单链的原始吸光度值及离心后上清液的吸光度值，计算出与凝血酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；再向上述硅纳米微球溶液中加入3’端修饰有羧基的溶菌酶适配体互补DNA单链10~50μL，混合溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺溶液20~100μL，反应30-50min后，高速离心15min，取上层清液测定紫外吸光度值，可计算出与溶菌酶的核酸适配体互补的DNA链接枝量；最后将该修饰有凝血酶及溶菌酶的核酸适配体互补DNA单链的硅纳米微球，用硼酸缓冲液和二次水洗涤后，重新溶于二次水中待用；

其中，3’端修饰有羧基的凝血酶的核酸适配体互补的DNA单链的浓度为50~150nM，N-羟基丁二酰亚胺溶液的浓度为0.5~1.0mg/mL，3’端修饰有羧基的溶菌酶适配体互补DNA单链的浓度为50~150nM，N-羟基丁二酰亚胺溶液的浓度为0.5~1.0mg/mL；

③基于核酸适配体的双荧光探针的制备：固定有两种核酸适配体互补DNA单链的硅纳米微球溶解于杂化缓冲液中，得到的溶液中硅纳米微球浓度为100~200mg/mL，先加入5’端修饰Cy5的凝血酶适配体，在室温下振荡反应0.5~2小时后，再加入5’端修饰CdTe QDs的溶菌酶适配体，在室温下振荡反应0.5~2小时，离心后，取沉淀重新溶于水，即得基于硅纳米微球与核酸适配体的双荧光探针，

其中，5’端修饰Cy5的凝血酶适配体的浓度为20~100nM，5’端修饰CdTe QDs的溶菌酶适配体的浓度为20~100nM。