[发明专利]一种检测乙二胺四乙酸及其螯合物的胶体金试纸及其制备和检测方法

权利要求书

1.一种检测乙二胺四乙酸及其螯合物的胶体金试纸，包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，其特征在于，所述反应膜上具有包被乙二胺四乙酸-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区，所述结合物释放垫包被乙二胺四乙酸单克隆抗体-胶体金标记物；

所述乙二胺四乙酸-载体蛋白偶联物为乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物或乙二胺四乙酸-钥孔血蓝蛋白偶联物；

其制备方法为：取0.8-20 mg Aminobenzyl-EDT溶于50 μL二甲基亚砜，配制16-400mg/mL的Aminobenzyl-EDTA；取2.0-20.0 mg钥孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白溶于1mL HEPES缓冲溶液或碳酸盐缓冲液，配制成2-20mg/mL的载体蛋白溶液；将1mL 1%戊二醛溶液逐滴加入Aminobenzyl-EDTA溶液中，室温放置过夜以活化氨基；将活化的半抗原溶液逐滴加入到1mL2-20mg/mL的载体蛋白溶液中，于4℃或室温、pH7.5-10.5条件下振荡反应24 h；用超滤或透析的方法去除未反应的低分子物质，得到乙二胺四乙酸-钥孔血蓝蛋白偶联物或乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物；

所述乙二胺四乙酸单克隆抗体-胶体金标记物中的乙二胺四乙酸单克隆抗体是以乙二胺四乙酸-载体蛋白偶联物作为免疫抗原免疫试验动物后制备获得。

2.如权利要求1所述的检测乙二胺四乙酸及其螯合物的胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1) 制备包被乙二胺四乙酸单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2) 制备具有包被乙二胺四乙酸-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区的反应膜；

3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。

3.如权利要求2所述的检测乙二胺四乙酸及其螯合物的胶体金试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 将双功能乙二胺四乙酸与载体蛋白偶联，形成乙二胺四乙酸-载体蛋白偶联物；

(2) 用乙二胺四乙酸-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌乙二胺四乙酸的单克隆抗体杂交瘤细胞株；培养分泌乙二胺四乙酸的单克隆抗体杂交瘤细胞株，得到乙二胺四乙酸单克隆抗体；

(3) 用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

(4) 将制备的乙二胺四乙酸单克隆抗体加入步骤（3）制备的胶体金中，得到乙二胺四乙酸单克隆抗体-胶体金标记物；

(5) 将乙二胺四乙酸单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上，用含0.1-1.5%卵清蛋白的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制的缓冲液浸湿30秒，37 ºC烘2h，备用；

(6) 将乙二胺四乙酸-载体蛋白偶联物包被在反应膜上构成测试区，并将羊抗鼠IgG包被在反应膜上构成质控区，用含0.1%牛血清的封闭液进行封闭；

(7) 将样本垫用0.1-1.5%的兔血清蛋白、1-1.5%吐温-20、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制的缓冲液浸泡2h，37℃烘2h，备用；

(8) 乙二胺四乙酸及其螯合物检测用胶体金试纸卡的组装:在背衬上按顺序依次粘附反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样本垫，然后切成3mm宽的小条，加塑料盒，真空包装。

4.采用如权利要求1所述胶体金试纸检测乙二胺四乙酸及其螯合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将待测样品滴入试剂卡孔内，当乙二胺四乙酸及其螯合物在样品中浓度低时，胶体金抗体在层析过程中会被固定在反应膜上的乙二胺四乙酸偶联物结合，在测试区和质控区内会出现各一条红色条带；如果乙二胺四乙酸及其螯合物在样品中浓度高时，胶体金抗体与乙二胺四乙酸及其螯合物全部结合，从而在测试区内因为竞争反应不会与乙二胺四乙酸偶联物结合而不出现红色条带；阴性样品在检测过程中由于缺少抗原抗体竞争反应，将会在测试区与质控区内出现红色条带；

阳性：当质控区显示出红色条带，而测试区不显色时，判为阳性；

阴性：当质控区显示出红色条带，测试区同时也显示出红色条带，且测试区颜色接近质控线或者浅于质控线时，判为阳性；

无效：当质控区不显示出红色条带，则无论测试区显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效。