[发明专利]一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法

说明书

本发明公开了一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法。先对样品预处理得第一悬混液，再加入钢珠震荡破碎提取得到破碎后的第一悬混液，超声，离心，收集第一上清液和沉淀；第一上清液浓缩至近干，加入水溶性复溶液，钢珠，震荡复溶；高速离心，所得第二上清液为水溶性代谢提取物，可直接上机分析；收集的沉淀加入脂溶性代谢物提取液混匀，得第二悬混液；震荡破碎提取，超声，离心，收集下层溶液，氮吹的方法使所得下层溶液吹干，加入脂溶性复溶液，钢珠，震荡复溶；高速离心，所得为脂溶性代谢提取物，可直接上机分析。本发明所述方法操作简单、稳定性强、全面的、回收率高，对大量开展粪便和土壤代谢组学的相关研究具有重大的意义。

技术领域

本发明涉及粪便和土壤样品处理中以代谢组学分析为目的的全代谢物提取和处理方法。尤其涉及一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法。

背景技术

代谢组学作为继基因组学和蛋白质组学后兴起的新技术，是系统生物学的重要组成。代谢组学对某一时刻生物体内所有生命活动所涉及代谢物的质和量的变化情况进行综合分析，从而揭示生物体所处的生理状态。代谢组学具有高通量检测和强大的数据模型分析能力，已经广泛应用于众多研究领域，比如疾病诊断与机理、药物研发、污染物毒理、营养食品科学、植物学及生态学等。利用代谢组学可以高通量地筛选暴露-效应标志物，标志物本身就是毒性机制中的关键分子，与其它分子指标结合通过聚类和关联分析可发现重要毒性通路。

粪便是生物体最终的代谢产物集合体，富含大量的内源性代谢物以及微生物代谢物的信息，对于我们认识生命活动的生物学过程具有重要意义。

生态代谢组近年来引起了科学界的广泛关注，旨在研究生化因子影响与生态学现象之间的关系、生物群落中不同种群间的协同进化等等，在环境监测、生态系统预警等应用生态学及物种进化、生态型鉴别等理论生态学研究中显示出巨大潜力。生态代谢组研究涉及土壤样品，通过定性和定量测定某种扰动情况(如温度、湿度、环境污染等等)下土壤代谢组的变化，从而在代谢物层面表征对生态环境的影响。

粪便和土壤这类固体样品成分非常复杂，代谢物质种类繁多，物理性质差异较大，且基质干扰非常严重。目前常规的代谢组提取和处理方法过程繁琐，提取和处理过程容易造成污染和不确定因素，且通常伴随着代谢物质组的变性，活性丧失和代谢物回收率低下。而且由于往往采用单一的提取液，造成代谢组提取不完整的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、稳定性强、全面的、回收率高的粪便和土壤代谢组学研究样品的制备处理方法。

为实现上述目的，本发明提供一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于，其经过下列工艺步骤，

(1)样品预处理：取适量在-80℃冰箱内过夜预冷的粪便或土壤样品，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，低温破碎，按照100mg样品/1mL水溶性代谢物提取液的比例加入水溶性代谢物提取液，使其混匀，得到第一悬混液；(低温可使酶失活并防止代谢物发生降解)

(2)震荡破碎提取：按照100-200mg粪便或土壤样品/2颗钢珠的比例加入钢珠到所述第一悬混液，低温下震荡破碎得到破碎后的第一悬混液；

(3)超声提取：将所述破碎后的第一悬混液在冰上进行超声，进一步破碎样品使代谢物质溶出；离心，收集第一上清液和沉淀；

(4)将上述所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干后，再按照100-200mg粪便或土壤样品/200μL水溶性复溶液的比例加入水溶性复溶液，再按照100-200mg粪便或土壤样品/1颗钢珠的比例加入钢珠，震荡复溶；高速离心，所得第二上清液为水溶性代谢提取物，可直接上机分析；

(5)按照100mg粪便或土壤样品/1mL脂溶性代谢物提取液的比例加入向上述所得沉淀中加入脂溶性代谢物提取液，使其混匀，得第二悬混液；