[发明专利]一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法

权利要求书

1.一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于，其经过下列工艺步骤，

(1)样品预处理：取适量在-80℃冰箱内过夜预冷的粪便或土壤样品，放入冷冻干燥机，干燥至衡重，低温破碎，按照100mg样品/1mL水溶性代谢物提取液的比例加入水溶性代谢物提取液，使其混匀，得到第一悬混液；所述水溶性代谢物提取液的配方为：甲醇、乙腈、乙酸和水按照体积比为1:1:0.1:2形成的混合液；

(2)震荡破碎提取：按照100-200mg粪便或土壤样品/2颗钢珠的比例加入钢珠到所述第一悬混液，低温下震荡破碎得到破碎后的第一悬混液；

(3)超声提取：将所述破碎后的第一悬混液在冰上进行超声，进一步破碎样品使代谢物质溶出；离心，收集第一上清液和沉淀；

(4)将上述所得第一上清液放入旋转浓缩仪中，浓缩至近干后，再按照100-200mg粪便或土壤样品/200μL水溶性复溶液的比例加入水溶性复溶液，再按照100-200mg粪便或土壤样品/1颗钢珠的比例加入钢珠，震荡复溶；高速离心，所得第二上清液为水溶性代谢提取物，可直接上机分析；所述水溶性复溶液为甲醇、乙酸和水按照体积比1:0.05:1混合得到的混合液；

(5)按照100mg粪便或土壤样品/1mL脂溶性代谢物提取液的比例加入向上述所得沉淀中加入脂溶性代谢物提取液，使其混匀，得第二悬混液；所述脂溶性代谢物提取液的配方为：-20℃的三氯甲烷、异丙醇和甲醇按照体积比1:1:1混合得到的混合液；

(6)震荡破碎提取：将所得第二悬混液在0～4℃下震荡破碎得到破碎后的第二悬混液；

(7)超声提取：将所得破碎后的第二悬混液在冰上进行超声，进一步破碎样品使代谢物质溶出；离心，收集下层溶液，得到脂溶性代谢物溶液；

(8)使用氮吹的方法将上述所得下层溶液吹干，按照100-200mg粪便或土壤样品/200μL脂溶性复溶液的比例加入200μL脂溶性复溶液，再按照100-200mg粪便或土壤样品/1颗钢珠的比例加入1颗钢珠，震荡复溶；高速离心，所得第三上清液为脂溶性代谢提取物，可直接上机分析；所述脂溶性复溶液的配方为：异丙醇、乙腈和水按照体积比10:4:1混合得到的混合物。

2.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于，所述步骤(1)中的粪便为各种动物以及人类的粪便排泄物。

3.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(1)中的低温破碎为在液氮中研磨破碎。

4.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(2)、步骤(4)和步骤(8)中所使用的钢珠直径为1-3mm，为除去钢珠表面所吸附的外源性污染物，钢珠使用前经过清洗和400℃高温烘烤2小时。

5.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(2)和步骤(6)中的震荡破碎、步骤(4)和和步骤(8)中的震荡复溶，使用的频率为80-120Hz，时间为60-120s。

6.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(3)、步骤(7)中所述的超声，其使用的超声破碎仪功率为80～100w，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5～10min。

7.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(3)、步骤(7)中离心的条件为温度4℃，转速10000rpm，离心10min。

8.根据权利要求1所述的一种用于粪便和土壤代谢组学研究的样品制备处理方法，其特征在于：所述步骤(4)中水溶性复溶液为甲醇、乙酸和水按照体积比1:0.05:1混合得到的混合液.