[发明专利]一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法

说明书

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法。所述方法采用了连续流离心、中空纤维澄清过滤、超滤浓缩、分子筛纯化工艺，最大限度的增加了病毒的回收率，降低了杂蛋白的含量。本发明制备的猪伪狂犬病毒浓缩液、纯化抗原尤其适用于制备疫苗，相较于现有技术生产的猪伪狂犬病灭活疫苗而言，安全性更高，均一性更好，免疫效果更好，从根本上减少了疫苗的副反应。

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法。

背景技术

伪狂犬病(Porcine Pseudorabies)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的发生在多种家畜和野生动物体内的一种急性传染病，以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要发病症状。猪是伪狂犬病的唯一自然宿主，对其危害大。可致妊娠母猪流产，产死胎及胎儿干尸化。对初生仔猪则引起神经症状，出现运动失调，麻痹，衰竭死亡，病死率100％。成年猪多呈隐性感染。病猪、带毒猪及带毒鼠类是本病的主要传染源。猪既是本病的原发感染宿主，又是病毒的长期贮存者和排毒者，在伪狂犬病的传播上起着重要作用。伪狂犬病的传播和蔓延，给养殖业造成了巨大损失。

本病目前无特效治疗药物，对感染发病猪可注射猪伪狂犬病高免血清，对未发病受威胁猪进行紧急免疫接种。本病以预防为主，疫苗的免疫接种是预防和控制猪伪狂犬病的根本措施，目前国内外已研制出猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗、灭活疫苗和基因缺失疫苗，这些疫苗都能在一定程度上减轻或防治伪狂犬病的临床症状，从而减少造成的经济损失。

目前，我国商品化的猪伪狂犬病病毒疫苗主要是基因缺失活疫苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原纯净性，灭活工艺及佐剂等因素的影响。常规工艺生产的猪伪狂犬病毒灭活疫苗在临床应用中有一定的副反应，主要与病毒抗原中所含的抗原外成分有关。这些成分包括：病毒培养用动物细胞的残留蛋白质和残留DNA；培养基残留如小牛血清；灭活剂残留等。这些异源成分不仅会引起免疫动物的副反应，而且会大大降低疫苗的效力。以传统灭活全病毒作为抗原的纯化工艺主要以自然沉降、离心、膜包浓缩等工艺为主，生产的疫苗中有效抗原含量增加，同时有害物质残留量浓度也升高，导致疫苗产品存在安全性隐患。所以，提高病毒滴度和抗原纯净性是提升疫苗质量的基本途径。

中空纤维膜过滤技术是料液以一定的流速在膜的上表面循环，小于膜孔径的物质可以透过膜到透过端，而大于膜孔径的物质会被膜截留，从而实现目标物质的浓缩以及不同物质的分级分离。中空纤维柱具有纤维管状的开放式流道结构，无筛网的管状流道结构避免了料液的无规则剧烈湍流，因此具有更低的剪切力，温和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脱落和蛋白的聚集，同时有助于杂蛋白的透过和去除。

分子筛凝胶层析是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品在凝胶内运动时，由于分子量不同在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行绕道运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，包括如下步骤：

(1)取纯悬浮BHK细胞培养的猪伪狂犬病毒培养液，连续流离心取上清作为待澄清样品；

(2)将步骤(1)所得待澄清样品利用中空纤维柱澄清过滤，得到病毒澄清液；

(3)将步骤(2)所得病毒澄清液利用中空纤维柱超滤浓缩，得到病毒浓缩液；

(4)将步骤(3)所得病毒浓缩液利用分子筛凝胶层析柱层析，收集洗脱后的第一个洗脱峰，所得洗脱液即为高纯度的猪伪狂犬病毒。