[发明专利]一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法

权利要求书

1.一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取纯悬浮BHK细胞培养的猪伪狂犬病毒培养液，连续流离心取上清作为待澄清样品；

（2）将步骤（1）所得待澄清样品利用中空纤维柱澄清过滤，得到病毒澄清液，所述中空纤维柱的孔径为0.45μm~0.65μm，所述待澄清样品利用中空纤维柱澄清过滤的具体操作过程为：先透过60%~70%待澄清样品，然后补加与剩余样品等体积的0.01mol/L PBS溶液，继续透过，待透过样品的体积等于加入的PBS溶液体积后，再补加与剩余样品等体积的0.01mol/L PBS溶液，如此洗滤多次后，至残渣不能透过，收集透过端液体，得到病毒澄清液；

（3）将步骤（2）所得病毒澄清液利用中空纤维柱超滤浓缩，得到病毒浓缩液，所述中空纤维柱的孔径为500KD~750 KD，所述病毒澄清液利用中空纤维柱超滤浓缩的具体操作过程为：①维持跨膜压在10~15psi、循环流速为30 ~50L/min持续透过，待样品体积浓缩至起始体积的1/8~1/10时，补加0.01mol/L PBS溶液进行第一次洗滤，待样品体积浓缩至起始体积的1/16~1/20时，补加与样品等体积的0.01mol/L PBS溶液进行第二次洗滤，至样品再次浓缩至起始体积的1/16~1/20时，结束浓缩，收集浓缩后的液体；②用病毒澄清液起始体积1/16~1/20的0.01mol/L PBS溶液循环冲洗中空纤维，收集洗膜液；③将步骤①所得浓缩后的液体与步骤②所得洗膜液混合后，即为8~10倍浓缩的病毒浓缩液；

（4）将步骤（3）所得病毒浓缩液利用分子筛凝胶层析柱层析，收集洗脱后的第一个洗脱峰，所得洗脱液即为高纯度猪伪狂犬病毒，所述分子筛凝胶层析柱的填料为Sepharose 4FF琼脂糖凝胶层析填料。

2.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤（2）所述中空纤维柱澄清过滤时采用的跨膜压为2.0~3.0psi，进液端流速为60~80L/min。

3.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤（4）所述分子筛凝胶层析柱层析时，病毒浓缩液上样的线性流速为45~100cm/h，压力小于2.5bar，上样量控制在10%~15%柱体积，洗脱采用的洗脱液为0.01mol/L PBS溶液。

4.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤（4）所述分子筛凝胶层析柱层析的具体操作过程为：用0.5mol/L NaOH溶液对分子筛凝胶层析柱冲洗，再用无菌水冲洗直至pH为7.2，随后用0.01mol/L PBS溶液平衡分子筛凝胶层析柱至柱前柱后电导率一致，pH稳定在7.0，紫外检测UV280基线平稳；然后将步骤（3）所得病毒浓缩液上样，上样结束后，用洗脱液洗脱，待UV280值开始回升时，开始收集洗脱液，至第一洗脱峰结束停止收获洗脱液。

5.根据权利要求1所述的大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法，其特征在于，步骤（2）所述中空纤维柱的型号为：CFP-5-D-55A；步骤（3）所述中空纤维柱的型号为：UFP-500-E-55，步骤（4）所述分子筛凝胶层析柱的型号为BPG450/1000 Column。