[发明专利]一种等温核酸扩增的方法

说明书

本发明公开了一种等温核酸扩增的方法，所述方法在恒定的温度下进行，首先上游引物与靶标退火，然后在聚合酶的作用下延伸产生扩增靶标，同时利用双链间的动态解离原理使下游引物与扩增靶标退火，再在聚合酶的作用下延伸得到双链扩增产物，产生的双链扩增产物与带有酶切识别位点的引物退火，并在聚合酶的作用下延伸得到具有酶切识别位点的扩增产物，该产物在具有酶切功能的酶的作用下切割或切刻形成新的产物可重新作为另一个循环的底物，不断循环扩增，从而引发指数扩增。本发明的方法操作简单，反应迅速，只需要三条引物，一种聚合酶，一种具有酶切功能的酶，等温条件下即可完成扩增。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种等温核酸扩增的方法。

背景技术

近年来，寨卡病毒、埃博拉病毒、黄热病等一系列流行病的爆发已严重危害人类健康，由于此类病毒传播速度快，危害性大，世界卫生组织已发布紧急健康公告，迫切需要一种快速检测手段对流行病毒实施准确检测。但由于其病毒潜伏期长，不能够在短时间内对其进行免疫学检测，为进出口检验检疫部门带来巨大压力。而基于核酸的分子诊断技术可以很好的弥补免疫学检测所带来的缺点，其技术特点是能够在短时间内，对病原体的遗传物质核酸进行快速准确检测，为后续的筛查节省大量的时间和精力。目前，聚合酶链式反应(PCR)是体外扩增核酸序列最常用的方法。PCR方法使用少量双链核酸为模板实现指数式扩增，扩增结果使其具有高灵敏度的优点，因此该方法被广泛的用作克隆或核酸扩增的工具。但是该技术需要反复升降温的精密仪器、专业的技术人员、对技术的要求性较高，不利于广泛推广应用，且该技术无法对RNA等易降解的核酸进行一步法检测。为此，发展一种快速准确的等温核酸扩增方法对RNA实施一步法简单检测迫在眉睫。

为克服PCR方法存在的弊端，自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展一系列无需热变性的等温核酸扩增方法，如链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)、环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP)、交叉引物扩增(Cross Priming Amplification,CPA)等，这些方法的共同特点是扩增反应均在一个特定的温度下简单快速反应，从而大大的降低了对仪器的要求。

链置换扩增(Strand Displacement Amplification,SDA)是由沃克(Walker)等人于1992年开发的一种检测双链核酸扩增的方法。该方法主要是依赖于限制性内切酶和DNA聚合酶共同作用来完成的。其原理是首先使用热变性方法将双链DNA转变为单链，含有限制性内切酶识别序列的引物与单链模板结合，在DNA聚合酶作用下延伸形成模板的互补链，加入的外引物链置换下形成的模板互补链，另一个带有限制性酶识别序列的引物与形成的模板互补链结合并延伸，实验中采用硫代的特定碱基，使得内切酶切割双链中的一条链产生切口，聚合酶在切口处合成新的链并将原先的链置换下来同时补平酶切位点，被置换的链又与扩增引物互补而开启循环扩增。链置换扩增灵敏性高，可快速扩增获得单链DNA，但是该方法需要初始热变性的步骤；反应还需限制性内切酶，增加了额外的费用，需要四条引物的参与，体系复杂易引起非特异性反应；检测手段的局限，限制了它的应用范围。

环介导等温扩增(Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是由日本学者Notomi等人在2000年建立的一种新的体外扩增核酸特异性序列的方法，该方法主要利用4条特异性引物分别识别目标DNA的6个特定区域，通过2个环状结构和链置换反应实现核酸的快速等温扩增。LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。该方法反应迅速，有较好的灵敏度和特异性。但是此方法四条引物设计比较困难，需要特殊的设计软件，对设计人员要求高，易引起气溶胶污染而导致假阳性结果，并且在检测中多用于定性而不是定量检测。上述不足在一定程度上限制了该技术的推广应用。