[发明专利]一种等温核酸扩增的方法

权利要求书

1.一种等温核酸扩增的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)等温核酸扩增引物组引物包括：上游引物P1、下游引物P2、一条带有具有酶切识别位点的特异性引物P3；

(2)步骤(1)中的两条上游引物P1、下游引物P2与靶核酸序列杂交，在聚合酶的作用下延伸，所得扩增产物在反应温度下发生动态解离，两条引物侵入扩增产物形成指数式扩增，得到扩增产物，扩增产物在反应温度下动态解离；

(3)步骤(2)或步骤(4)的动态解离产物与带有具有酶切识别位点的特异性引物P3结合，在聚合酶的作用下延伸得到带有酶切识别位点的扩增产物；

(4)步骤(3)得到的带有酶切识别位点的扩增产物在具有酶切功能的酶的作用下切割或切刻，酶切产物在反应温度下双链间发生动态解离。

2.根据权利要求1所述的一种等温核酸扩增的方法，其特征在于，所述上游引物P1、下游引物P2能够与靶核酸序列实现延伸、解离，上游引物P1和下游引物P2的选择应满足如下条件：

(1)引物退火温度应不高于反应温度5℃；

(2)上游引物P1、下游引物P2的3'端之间靶核酸序列的碱基数不超过30bp，特别地不超过10bp；

(3)步骤(2)所得扩增产物在反应温度下的动态解离程度大于1％。

3.根据权利要求1所述的一种等温核酸扩增的方法，其特征在于，所述带有具有酶切识别位点的特异性引物P3长度的选择应满足如下条件：

(1)带有具有酶切识别位点的特异性引物P3与扩增产物杂交部分的退火温度不高于反应温度5℃；

(2)带有具有酶切识别位点的特异性引物P3的3'端与上游引物P1、下游引物P2和靶核酸序列不互补，因此不能够延伸；

(3)所述带有酶切识别位点的扩增产物经酶切割或切刻后所形成的酶切产物的退火温度不高于反应温度5℃。

4.根据权利要求1所述的一种等温核酸扩增的方法，其特征在于，整个过程反应温度恒定不变，反应温度范围为55-73℃，更进一步，反应温度为61-65℃。

5.根据权利要求1所述的一种等温核酸扩增的方法，其特征在于，所述扩增的靶核酸序列是DNA序列或RNA序列。

6.根据权利要求1所述的一种等温核酸扩增的方法，其特征在于，在反应体系中添加抑制产生非特异性扩增的物质，所述抑制产生非特异性扩增的物质为PEG-200或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。

7.根据权利要求1所述的一种等温核酸扩增的方法，其特征在于，所述聚合酶为嗜热性聚合酶或衍生嗜热性聚合酶，所述嗜热性聚合酶为Bst聚合酶，所述衍生嗜热性聚合酶为Bst 2.0聚合酶或Bst 2.0 warmstart聚合酶。

8.根据权利要求1所述的一种等温核酸扩增的方法，其特征在于，所述具有酶切功能的酶为嗜热性内切酶或嗜热性切刻酶，所述嗜热性内切酶为Bsr I内切酶，所述嗜热性切刻酶为Nt.BstNB I切刻酶。

9.根据权利要求1或5所述的一种等温核酸扩增的方法，其特征在于，当靶核苷酸序列为RNA时，所述聚合酶具有反转录活性或反转录酶的酶反应温度与聚合酶的反应温度一致。