[发明专利]五种食源性病原菌微流控芯片快速检测技术及试剂盒

说明书

本发明属于食品卫生安全快速检测领域；本发明通过提供五种针对大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌特定基因片段具有特异性的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌进行检测；本方案提供的五种食源性病原菌微流控芯片快速检测技术及试剂盒具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携等诸多优点。

技术领域

本发明属于食品卫生安全快速检测领域。涉及微流控芯片快速检测技术和环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术；涉及大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌五种食源性致病菌特定基因保守序列具有的特异性引物和引物组；还涉及将引物和引物组用于等温扩增法检测大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌五种食源性致病菌的检测方法和检测试剂盒。

背景技术

近年来我国食品安全频频出现问题，由病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。常见细菌性食物中毒的病原微生物有：致病性大肠杆菌（特别是出血性大肠杆菌O157:H7）；沙门氏菌属；志贺氏菌；致病性弧菌（包括：霍乱弧菌、副溶血性弧菌）；金黄色葡萄球菌及其肠毒素；近年来发现导致细菌性食物中毒的微生物越来越多，包括单核增生李斯特菌、空肠弯曲菌等。

食源性致病菌检测执行标准中主要检测方法为培养法、ELLISA法和PCR法。其中培养法是采用最广泛的方法，结果准确。但耗时多，操作复杂，人员需要专业训练。ELLISA法操作步骤较多，敏感性不佳，容易出现假阴性。

PCR技术从诞生至今已经30多年，期间不断发展和突破。本发明使用的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification）技术(国际专利号W0 00/28082)是2000年由Notomi等开发的核酸扩增技术。该技术使用一种在65℃恒温条件具有链置换活性的DNA聚合酶，催化针对靶基因6个区域设计的6条特异性引物以靶基因为模板进行扩增。扩增副产物焦磷酸与HNB（羟基萘酚蓝）发生显色反应。该方法特异性和敏感性都优于传统PCR技术，并且恒温扩增，对仪器无特殊要求。检测速度快，结果易读。

微流控芯片采用类似半导体的微机电加工技术在芯片上构建微流路系统，将实验与分析过程转载到由彼此联系的路径和液相小室组成的芯片结构上，加载生物样品和反应液后，采用微机械泵、电水力泵和电渗流等方法驱动芯片中缓冲液的流动，形成微流路，于芯片上进行一种或连续多种的反应。激光诱导荧光、电化学和化学等多种检测系统以及与质谱等分析手段结合的很多检测手段已经被用在微流控芯片中，对样品进行快速、准确和高通量分析。微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复合体系的微全分析系统。它的目标是把整个化验室的功能,包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上。具有检测通量高、样品量和试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携等诸多优点。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种五种食源性病原菌微流控芯片快速检测试剂盒，用来克服现在没有类似相同功能产品的问题。