[发明专利]一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，将合成的Leader‑scFv(CEA)‑CD8‑CD137‑CD3ζ‑T2A‑HSV‑TK的基因片段插入到pLent‑C‑GFP载体将所述质粒转染293T细胞，包装成携带有Leader‑scFv(CEA)‑CD8‑CD137‑CD3ζ‑T2A‑HSV‑TK编码基因的慢病毒，将所述携带有Leader‑scFv(CEA)‑CD8‑CD137‑CD3ζ‑T2A‑HSV‑TK编码基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰的T细胞，该发明豁免正常细胞，在保证疗效的同时降低“脱靶效应”，提高安全。

技术领域

本发明涉及及生物与新医药技术领域，更具体的说，是一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其应用。

背景技术

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)是一种高表达多种恶性肿瘤的酸性糖蛋白，如表达95％以上的结肠直肠癌，90％左右的胃癌、胰腺癌，80％以上的非小细胞性肺癌，50％左右的乳腺癌。因此CEA已被公认为肿瘤标志物之一，使之成为肿瘤靶向治疗和诊断的最佳靶位之一。

传统的治疗CEA肿瘤方法包括手术、放疗、化疗等远不能满足广大癌症患者的要求，每年因CEA肿瘤而死亡的人数是全部肿瘤死亡人数的60％以上，是人类健康的严重威胁。而以癌胚抗原嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor CAR)修饰T细胞(CAR-T)过继性地靶向免疫治疗已成为CEA肿瘤治疗的富有希望的疗法。目前CAR-T技术已在急性白血病、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的治疗上有着显著的疗效，但也引起了“脱靶效应”和“细胞因子风暴”等不良反应。因此，在保证CAR-T细胞治疗效果的前提下，如何提高CAR-T细胞的安全性是目前临床应用面临的首要问题。

发明内容

为了弥补以上不足，本发明提供了本发明提供一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰的T细胞。

本发明的方案是：

一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，将Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK核苷酸合成，将合成的Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK的基因片段插入到pLent-C-GFP载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，经测序正确后，构建成质粒，将所述质粒转染293T细胞，包装成携带有Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK编码基因的慢病毒，将所述携带有Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK编码基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰的T细胞。

作为优选的技术方案，所述Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK的基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种将单核细胞诱导的异质T淋巴细胞制备如下：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞，用重组干扰素α2a的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素2、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率；CD3+阳性率80％，CD3+CD56+双阳性率20％，获得单核细胞诱导的异质T淋巴细胞。