[发明专利]一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于：将Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK核苷酸合成，将合成的Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK的基因片段插入到pLent-C-GFP载体的NotI-AsiSI位点，经测序正确后，构建成质粒，将所述质粒转染293T细胞，包装成携带有Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK编码基因的慢病毒，将所述携带有Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK编码基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到安全型抗 CEA嵌合抗原受体修饰的T细胞；

所述Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK的基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列；

所述scFv(CEA)的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于，所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞制备如下：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞，用重组干扰素α2a的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素2、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率；CD3+阳性率80％，CD3+CD56+双阳性率20％，获得单核细胞诱导的异质T淋巴细胞。

3.如权利要求1所述的一种安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰T细胞的制备方法，其特征在于，将所述质粒转染293T细胞，包装成携带有Leader-scFv(CEA)-CD8-CD137-CD3ζ-T2A-HSV-TK编码基因的慢病毒的方法：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS10cm培养皿中，37℃，5％的CO₂条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染，所述质粒采用磷酸钙转染法转染293T细胞，转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落；48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达；72h后，收集上清，过滤除菌，获得慢病毒，在-80℃低温冰箱中保存备用。

4.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于：含有权利要求1所述的安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰的T细胞。

5.权利要求1所述的安全型抗CEA嵌合抗原受体修饰的T细胞用于制备治疗高表达CEA的恶性肿瘤的药物的用途。