[发明专利]包含内部标记引物的核酸的测序、扩增和检测方法

说明书

本申请为国际申请日2012年5月4日、国际申请号PCT/EP2012/058259于2013年11月6日进入中国国家阶段、申请号201280022096.0、发明名称“包含内部标记引物的核酸的测序、扩增和检测方法”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物学和化学领域，特别是分子生物学领域。更具体来说，本发明涉及用于核酸测序或扩增和检测的方法和试剂盒。

背景技术

如今，分子方法在诊断学和鉴定个体，例如在法医学领域或亲子鉴定中发挥重要作用。靶区域的扩增是这些方法中的中心程序。此外，方法包括在大多数情况下通过凝胶电泳如毛细管电泳来分析被扩增靶区域的长度。被扩增材料的分析通过荧光标记物的检测来进行。将标记物附连到用于扩增的位点特异性引物的5’-末端。然而，当分析扩增产物时，小的干扰性人为峰、即所谓的“染料污迹(dye blobs)”的出现，导致基线具有高的“背景噪音”，这干扰了方法的灵敏度。“染料污迹”是电泳图中不代表特异性扩增产物，而是代表包含标记物的降解产物的峰。造成它们的分子是游离的荧光染料标记物以及与标记物相连的1-8bp长的寡核苷酸。后者可能代表降解的引物或降解的PCR产物。

现在，本发明人出人意料地发现，内部标记的寡核苷酸引物的使用减少了染料污迹的出现。因此，本申请提供了用于测序或扩增和检测核酸的方法，所述方法包括使用内部标记的核酸引物。使用内部标记的引物的技术效果是提供了具有更高灵敏度的方法。

发明内容

因此，本发明解决了上面提到的问题，并提供了用于测序或扩增和检测核酸的方法，所述方法包括下列步骤：

i)提供至少一种核酸引物，其包含至少一个标记的核苷酸，

ii)提供酶和试剂，其使用所述至少一种标记的核酸引物来扩增靶核酸，

iii)将反应组分在适合于靶核酸引物的扩增的条件下温育，

iv)通过标记的核苷酸来检测扩增的核酸，

其中所述核酸引物包含下列序列：

5’-N_aXN_b-3’，

其中N可以是任意核苷酸或修饰的核苷酸，

其中a和b表示核苷酸数量，并可以在1至150的范围内；

并且其中X是所述至少一个标记的核苷酸。

在本文中，“核酸引物”是指适用于扩增的寡核苷酸。本领域技术人员应该理解，为了适用于扩增，3’-末端应该可以通过聚合酶进行延伸。核酸引物可以使用任何适合的方法来制备，例如磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自动化实施方式。在一种这样的自动化实施方式中，使用二乙基-亚磷酰胺作为起始原料，其可以如Beaucage等，Tetrahedron Letters,22:1859-1862(1981)所述进行合成，该文献通过引用并入本文。一种在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的方法描述在美国专利号4,458,006中，所述专利通过引用并入本文。还可以使用从生物样品(例如限制性内切酶消化物)分离的引物。核酸引物的长度可以各不相同。长度可以适应于需要。

在本发明的方法的情形中，“核酸”是指样品中特定类型的核酸，尤其是RNA、DNA、cDNA(互补DNA)、LNA(锁核酸)、mRNA(信使RNA)、mtRNA(线粒体的)、rRNA(核糖体RNA)、tRNA(转运RNA)、nRNA(核RNA)、siRNA(短干扰RNA)、snRNA(小核RNA)、snoRNA(小核仁RNA)、scaRNA(小卡哈尔体特异性RNA)、microRNA、dsRNA(双链RNA)、核酶、核糖开关、病毒RNA、dsDNA(双链DNA)、ssDNA(单链DNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、病毒DNA、mtDNA(线粒体DNA)、nDNA(核DNA)、或snDNA(小核DNA)等，或可以与样品中主体核酸区分开的任何其他类型或亚类的核酸。