[发明专利]一种重组α-半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种重组α‑半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。酿酒酵母是食品安全菌，构建的重组α‑半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌产α‑半乳糖苷酶，可以进行豆类、糖蜜的发酵加工，可以去除发酵原料中的抗营养因子不良寡糖，提高食品、饲料的营养价值和消化吸收率，提高资源的利用率。酿酒酵母中转入的α‑半乳糖苷酶源于嗜热真菌米赫根毛霉(R.miehei)，有一定的热稳定性。本发明的工程菌产生的重组α‑半乳糖苷酶则有一定的热稳定性，其最适温度在60℃，在60℃水浴80min后还可以保持80％的活性。

(一)技术领域

本发明涉及一种重组α-半乳糖苷酶基因、载体、工程菌及其应用，该菌株或产生的酶可以应用于饲料、食品中的抗营养因子的降解，应用于造纸工业中的纸浆预处理、临床医疗中的器官移植或血型改造等。

(二)背景技术

大豆是重要的食品原料，可以加工成豆奶等营养丰富的食品。豆粕是大豆工业的主要固态副产物，是我国非常重要的饲料原料之一。但是，大豆中含有大量的难以消化的不良寡糖，如棉子糖、水苏糖等α-半乳寡糖。这些不良寡糖是抗营养因子，不能很好地被人或动物吸收利用，而在肠道中经过厌氧发酵产生大量气体，引起腹胀、腹泻、胃肠痛等现象。

甘蔗糖蜜是蔗糖生产过程的副产物，其中含有大量的糖分，常被用作工业微生物发酵的培养基碳源。利用糖蜜发酵生产有用的物质不仅可以解决蔗糖生产污染环境问题，而且能够实现资源化利用，具有重要的意义。但是，甘蔗糖蜜还含有一部分不能被酿酒酵母等食品级生物安全微生物利用的糖分，主要由蜜二糖、棉子糖、水苏糖等构成，通常占甘蔗糖蜜总重量的5％。

α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)，是一种可以催化α-半乳糖苷键的水解的外切水解酶，催化移除不同底物中α-连接的末端非还原D-半乳糖，水解棉籽糖、水苏糖、半乳甘露聚糖及半乳糖脂等。因此，该酶可以消除豆粕、糖蜜中的棉籽糖和水苏糖等抗营养因子，可以作为添加剂应用于食品、饲料工业，提高食品或饲料的消化吸收率和营养价值。

此外，α-半乳糖苷酶还可以用在医疗、造纸业中。细胞溶酶体内α-半乳糖苷酶酶活降低可以引起一种的罕见的遗传性疾病Fabry病。目前，对该病进行α-半乳糖苷酶替代疗法疗效可以得到增强。α-半乳糖苷酶还可以用来水解抗原、改造血型，从而降低异种器官移植、输血过程中的免疫排斥反应。而在造纸工业中，α-半乳糖苷酶可以水解软木中的半纤维成分半乳葡聚甘露聚糖，分离出其中的α-半乳糖，对纸浆预处理有一定的作用。

α-半乳糖苷酶在植物(水稻、豆芽、咖啡豆、葡萄等)、细菌(链霉菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、双歧杆菌和巨大芽孢杆菌)中、真菌(根霉、青霉、黑曲霉、米曲霉)等生物中存在。但是，在酿酒酵母、乳酸菌等常用的食品安全级的微生物中，酶活很低，甚至没有该酶。因此，将其他生物来源的α-半乳糖苷酶基因克隆，利用基因工程技术转入酵母菌等，然后进行食品、豆粕的发酵加工，不仅可以去除不良寡糖抗营养因子，还可以提高益生菌的数量，提高食品、饲料品质。此外，转α-半乳糖苷酶基因的酵母菌在培养的时候，可以充分利用糖蜜中的难发酵糖，提高资源利用率。虽有将α-半乳糖苷酶转入毕赤酵母的报道(CN105219791A)，但是毕赤酵母不是饲料、食品等加工的生物安全菌(见《饲料添加剂品种目录(2013)》)，而酿酒酵母是啤酒发酵、酿造、豆粕类加工的可食用生物安全菌。此外，普通的α-半乳糖苷酶热稳定性差，不便于食品、饲料加工。因此，需要构建转α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母，还需要克隆热稳定性好、耐高温的α-半乳糖苷酶基因并转入酿酒酵母。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种重组α-半乳糖苷酶基因及其重组基因工程菌酿酒酵母，该工程菌可以产生α-半乳糖苷酶并应用于食品、饲料加工、生产α-半乳糖苷酶等，可以去除不良寡糖等抗营养因子。酿酒酵母被用于豆类食品加工、豆粕饲料加工等，但是酿酒酵母几乎没有α-半乳糖苷酶活性，不能去除豆类中的不良寡糖。本发明构建的重组α-半乳糖苷酶基因酿酒酵母工程菌具有α-半乳糖苷酶活性，可以去除不良寡糖。

本发明采用的技术方案是：