[发明专利]一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白检测技术，特别涉及一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法。

背景技术

脱-r-羧基凝血酶原(Des--carboxy-prothrombin,DCP)是肝细胞癌产生的异常凝血酶原，与正常凝血酶原相比，DCP的分子结构特点是其丙氨酸结构域(Gla domain)中的一个或者多个谷氨酸(Glu)残基没有被完全羧化成为Gla,从而失去凝血功能。正常的凝血酶原是在肝细胞微粒体内，主要依赖维生素K的γ谷氨酰羧化酶及辅酶和Vitamin K reductase参与下，将结构Gla Domain中的第6,7,14,16,19,20,25,26,29和32位的10个Glu残基羧化为Gla,成为有活性的凝血酶原，上述任何一位点或多位点的Glu残基羧化不全，都可形成DCP,使凝血酶原失去凝血功能。

研究表明，原发性肝癌血清中的DCP明显升高。陆枫林等人发表的《去γ-羧基凝血酶原对原发性肝细胞癌的诊断价值》中国肿瘤临床2009年07期，其揭示，DCP值与肿瘤大小呈正相关关系。因此，准确监测血清中DCP水平对于临床医生判断预后、选择治疗方案以及观测疗效具有重要意义。由于临床检测中，对于医院，每天需要检测大量的样本，高通量芯片检测可大幅度提高检测效率。即低成本、快速高效、准确、高通量检测手段是最好的选择，但是目前没有关于高通量检测DCP的报道。

现有检测方法中检测血清DCP的方法有:电化学发光免疫分析技术、液相亲和免疫方法、免疫沉淀法、western blot、ELISA等。本领域技术人员知道，临床血清非常复杂，不仅仅包含其它肝癌的其它标志物，而且由于血清中DCP非常低，待测血清DCP受多种非特异物理吸附或者非特异结合的影响，比如凝血素、凝血酶和纤维素及其类似物等的干扰较大。

因此，为了保证检测结果的准确性，灵敏性和特异性，上述采用免疫原理的检测方法中，都有一个共同的特点，即每个检测反应所采用的血清量少则50-100ul，多则3-5ml，对应地，每个检测就需要大量抗体完成，例如CN101377505A中公开的微孔板化学发光免疫分析测定方法，每孔中需要加入含有DCP抗体的包被液150ul，所需血清样品量需要50ul，而且，虽然该文件中公开其最低检测限可达到4.37mAU/ml，但是其记载的实验中并未采用真正的临床血清来验证其检测特异性和准确性，其检测数据来自于正常血清中加入标准品而得的人工样品。而且这些方法的检测时间长达3-4小时，由于依据这些方法，做成高通量芯片的话，用于每个样品的检测斑或捕获斑的尺寸将会做得很大，成本非常高，失去了做成集成芯片的意义，即无法实现高通量及低成本的目的，在门诊中普及并不现实。实现DCP高通量检测，需要进行更多探索。

发明内容

本发明基于蛋白芯片领域在检测血清DCP的空白，提供了一种适合于检测血清中DCP的高通量蛋白芯片、试剂盒及其制备方法，在保证检测准确性，灵敏性和特异性的前提下，最大限度地节省了抗体、血清用量，适合于临床使用，具有省时、经济、准确、便捷的优点。

本发明的技术方案如下：

本发明一方面提供一种检测血清异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片，其特征在于：

所述蛋白芯片的基质载片上设置多个检测亚区，每个所述检测亚区用于检测一份血清样品；所述每个所检测亚区内设置有检测斑区域和对照斑区域，所述检测斑区域有通过喷涂微量DCP特异性抗体形成的检测斑，所述对照斑区域内有通过喷涂牛血清白蛋白形成的对照斑；同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同；

形成每一个所述检测斑的DCP特异性抗体的总量为3-5L,浓度为3-5mg/mL，每个检测斑通过非接触式点样仪分6-10次，喷涂300-500pL的方式形成，检测斑直径为0.5-1mm。

优选地，每个所述检测斑区域包括排列成1排的4-8个相互分隔的检测斑，所述对照斑区域包括排列成1排的4-8个相互独立分隔的对照斑；所述检测斑和对照斑排成平行的两列。

优选地，芯片的长、宽、厚度为76.4mm、25.2mm、1mm，所述基质载片上设置10个所述检测亚区。

优选地，所述检测亚区之间设置有凸起作为物理隔断。

优选地，所述DCP的特异性单克隆抗体为鼠抗人DCP。

本发明另一方面提供一种用于检测异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：