[发明专利]一种具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株及应用

说明书

本发明公开了一种具有S‑雌马酚抗性的大肠杆菌突变株及应用，所述具有S‑雌马酚抗性的大肠杆菌突变株是将来源于乳酸菌(Lactococcus sp.)20‑92的L‑DDRC、L‑DZNR、L‑DHDR和L‑THDR基因克隆至大肠埃希氏菌BL21‑G2中转化得到；本发明提供一种发酵条件简单、使用方便、体系稳定、应用广泛且具有抗S‑雌马酚功能的大肠杆菌突变株，无论是在厌氧还是有氧条件下，均具有将LB培养基中的大豆素转化为S‑雌马酚的能力，且本发明工程菌DDDT‑G2是专利申请2014102431488中工程菌DDDT‑BL21产雌马酚量的1.25‑2倍。

(一)技术领域

本发明涉及一种突变工程菌的筛选与应用，特别涉及一种具有抗S-雌马酚功能的大肠杆菌突变株筛选及其在大豆素转化生产S-雌马酚中的应用。

(二)背景技术

S-雌马酚是一种植物雌激素，是豆类食物在肠道中经特定微生物转化后产生的一种代谢产物，比其相应的前体大豆异黄酮的生物活性更高。相比雌激素，S-雌马酚与雌激素-β受体结合度更强，因此S-雌马酚能预防各种具有雌激素依赖性的癌症。大量的临床研究表明豆类食物预防各种心血管疾病、妇女更年期综合征、妇科癌症和美白护肤等作用均归咎于其代谢产物S-雌马酚的生物学活性，故人体能否将大豆素代谢为S-雌马酚是决定大豆能否发挥其抵御各种疾病的关键因素。然而科学研究报道，在常吃大豆类食物的亚洲仅只有30％-50％的人能将大豆代谢成雌马酚，西方国家更低，所以雌马酚在临床预防各类疾病的作用愈加重要。

目前生产S-雌马酚的方法主要为化学合成和微生物合成，其存在的两个问题就是：(1)微生物大规模发酵合成雌马酚时存在产物(S-雌马酚)浓度过高从而抑制工程菌生长的局限性；(2)化学合成需要金属催化剂、氢气、高压高温等，对生产设备要求高、产量低、中间产物多、分离纯化难、成本较高。所以能否采用生物法大规模合成S-雌马酚成为大家关注的热点。对现有技术的文献检索发现，目前与本发明密切相关的专利有“一种S-雌马酚产生工程菌及应用”(申请号：201410243148.8)，“不动杆菌AUH-JLM455及其转化制备S-雌马酚的方法”(申请号：200810147314.9)，“雌马酚产生菌及利用”(申请号：201080007863.1)，“含有产生雌马酚的乳酸菌的组合物”(申请号：200480020952.4)，“含有维持了雌马酚产生能力的雌马酚产生微生物的发酵制品及其制备方法”(申请号：200980136848.4)，“一种奇异变形杆菌菌株及其转化大豆素元生产S-雌马酚的方法”(申请号：201210146746.4)，“一种屎肠球菌及其产生雌马酚的方法与应用”(申请号：201110086803.X)和“一株降解大豆素原产生雌马酚的双酶梭菌及其菌剂和应用”(申请号：201010513344.4)。以上这些专利均是使用从肠道中分离获得的单一或少数几种细菌混合厌氧发酵生产S-雌马酚，但研究发现现有微生物合成的方法有明显缺陷，当大规模生产雌马酚时，产物雌马酚浓度过高会抑制产雌马酚工程菌的生长，这会很大程度限制生物合成法生产雌马酚的转化率和成本。

(三)发明内容

本发明目的是针对目前微生物发酵生产过程中发酵产物S-雌马酚具有抑制工程菌生长的不足，采用海洋转座子突变文库筛选的方法，获得了一株具有S-雌马酚抗性的大肠杆菌突变株G2。发现突变株G2比本底大肠杆菌BL21在利用大豆素发酵生产S-雌马酚过程中具有生长速度更快、产量更高的优势。

本发明采用的技术方案是：