[发明专利]一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业和植物检疫技术领域，具体涉及一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法。

背景技术

油菜茎基溃疡病是油菜上最严重的真菌病害之一，其致病菌为小球腔菌属的油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans)，该病菌致病力强，能引起油菜茎基部发生溃烂，严重时可导致油菜减产达30％-50％，甚至更高。油菜茎基溃疡病菌在澳大利亚、加拿大、美国、欧洲等油菜主产国有发现，而在中国未见报道，属于中国进境植物检疫性有害生物。近年来，在我国出入境检验检疫机构从进口澳大利亚、乌克兰和加拿大等国进境油菜籽中多次截获茎基溃疡病菌L.maculans。中国油菜产区气候与澳大利亚、美国、欧洲三大州相似，且中国目前的油菜主要栽培品种高度感病。此外，随着贸易全球化，病菌传入的风险加剧。为防止油菜茎基溃疡的传入，高效快速检测成为预防油菜茎基溃疡病传入中国的技术关键。

目前，用于油基茎基溃疡病菌的检测方法主要有滤纸培养法、PCR方法和环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)检测方法。常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，用时在90分钟左右。LAMP扩增方法针对靶基因序列的6个不同区域设计4种特异性LAMP引物，利用一种链置换活性的Bst DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)孵育30-60min，完成扩增。重组酶介导等温扩增(RPA)技术被认为是可以取代PCR的核酸检测技术。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快核酸扩增速度。RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物探针组合及检测方法。

本发明提供了一种引物对，由引物F和引物R组成；

所述引物F为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。

本发明还保护引物探针组合，由所述引物对和探针组成；

所述探针如下所示：

区段A-(dT-荧光基团)-四氢呋喃残基-(dT-猝灭基团)-区段B；

在所述探针的3'端进行修饰；

所述区段A如序列表的序列3所示；

所述区段B如序列表的序列4所示。

所述荧光基团为FAM；所述淬灭基团为BHQ1。

所述“在所述探针的3'端进行修饰”为采用C3-spacer或磷酸盐或生物素-TEG或胺进行修饰。

所述引物对或所述引物探针组合的用途为如下(b1)-(b4)中的至少一种：

(b1)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌；

(b2)检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌；

(b3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌的试剂盒；

(b4)制备用于检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌的试剂盒。

本发明还保护所述引物对或所述引物探针组合的应用，为如下(b1)-(b4)中的至少一种：

(b1)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌；

(b2)检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌；

(b3)制备用于鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌的试剂盒；

(b4)制备用于检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌的试剂盒。

本发明还保护含有所述引物对的试剂盒甲，或，含有所述引物探针组合的试剂盒乙；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：

(c1)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为油菜茎基溃疡病菌；

(c2)检测待测样本中是否含有油菜茎基溃疡病菌。