[发明专利]一种以D101大孔吸附树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法

说明书

本发明涉及一种以D101大孔吸附树脂提高屎肠球菌谷氨酸脱羧酶活性的方法，属于生物技术领域；本发明是以D101大孔吸附树脂作为屎肠球菌谷氨酸脱羧酶的酶活促进剂，按照D101大孔吸附树脂质量∶底物溶液体积∶屎肠球菌菌悬液或谷氨酸脱羧酶游离酶液体积为1∶1∶1的比例混合构建D101大孔吸附树脂‑谷氨酸脱羧酶复合催化体系，当于80 r/min、37～43℃水浴振荡器反应或搅拌罐中低速搅拌反应24 h～36 h，γ‑氨基丁酸的产量可提高18.54%～149.11%。D101大孔吸附树脂除了显著提高谷氨酸脱羧酶的活性外，其对γ‑氨基丁酸的交换吸附作用也是γ‑氨基丁酸纯化的过程，简化了下游提取纯化工艺，降低生产成本；方法简便，绿色环保。

技术领域

本发明涉及一种以D101大孔吸附树脂提高谷氨酸脱羧酶活性的方法，属于生物技术领域。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)是一种具有4个碳原子的非蛋白质组成氨基酸，为哺乳动物中枢神经系统主要的抑制性神经递质，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血压、镇静和改善睡眠等作用，已成为备受关注的药品和保健品成分。由于可以通过内酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，因此γ-氨基丁酸还是生产生物塑料聚酰胺4的重要原料。

微生物生长繁殖快，以其生产γ-氨基丁酸不受时间和空间限制，因此通过微生物谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)生产γ-氨基丁酸备受关注。谷氨酸脱羧酶是一种依赖于磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate，PLP)的裂解酶，存在于细胞质中，是生物体催化L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)发生α-羧基脱羧作用生成γ-氨基丁酸的唯一酶。由于谷氨酸脱羧酶作用的底物(L-谷氨酸)和产物(γ-氨基丁酸)均为小分子，可以透过细胞膜，因此可以直接采用细胞转化法生产γ-氨基丁酸，减少胞内酶的提取成本，简化生产工艺。已有文献通过唾液链球菌嗜热亚种、戊糖片球菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、大肠杆菌细胞转化法制备γ-氨基丁酸的报道。

陆兆新、杨胜远等在中国专利(专利号ZL 200510040758.9)中公开了一种γ-氨基丁酸的生产方法，它是以唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)为菌种，作用于谷氨酸、谷氨酸盐、含谷氨酸或谷氨酸盐的物质，使谷氨酸的α-羧基发生脱羧作用，从而生成γ-氨基丁酸。

吴天祥等在中国专利(公开号CN101240301)中公开了固态发酵制备γ-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：首先以腐乳为原料筛选出红曲霉菌种；接着将红曲霉MP1104菌种置于斜面培养基上培养7d，使菌种活化；然后发酵菌种转接到培养基中，在温度30℃、转速150r/min下将活化菌种摇床培养2d，制备发酵种子，优选固态发酵条件和培养基；最后将菌种在上一步骤中优选的培养基和培养条件下进行培养生产γ-氨基丁酸。该方法以大米为发酵原料，以红曲霉为菌种，具有食用安全性，可以作为保健食品直接食用；该方法的γ-氨基丁酸产量和纯度均高，在最佳发酵条件与培养基下，γ-氨基丁酸产量由初始的0.21mg/g可达到0.35mg/g，最终产品的纯度可以达到45％。

焦庆才等在中国专利(专利号ZL 200410064813.3)中公开一种γ-氨基丁酸的酶法转化制备方法，该制备方法用L-谷氨酸和L-天冬氨酸两种混合酸性氨基酸作为原料，将具有高活力L-谷氨酸脱羧酶的埃希氏菌Escherichia coli AS1.505的菌体细胞与含有L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的转化液混合，28-45℃下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的γ-氨基丁酸和L-天冬氨酸。该方法解决了两种酸性混合氨基酸高效分离的难题，得到了附加值较高的γ-氨基丁酸，并具有原料价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低等优点。