[发明专利]光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种光学纯meso‑2,3‑丁二醇高产工程菌株的构建，该构建方法是将α‑乙酰乳酸合成酶基因、α‑乙酰乳酸脱羧酶基因和meso‑2,3‑丁二醇脱氢酶基因的核苷酸序列进行密码子优化，然后拼接获得包含该三个基因的基因簇，再将基因簇导入表达载体中获得多顺反子重组质粒，最后将重组质粒再导入宿主菌E.coli即得所述高产工程菌，该菌所用的合成原料来源广泛、成本低，菌株无致病性，菌株产量高、生产效率高、稳定性好，最高产量可达到91.5 g/L，光学纯度可达99%以上。本发明同时公开了上述高产工程菌株利用廉价木薯粉为碳源，利用棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉或花生蛋白粉为氮源在生产光学纯meso‑2,3‑丁二醇中的应用，降低了生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法，及其在利用廉价原料生产光学纯meso-2,3-丁二醇中的应用。

背景技术

2,3-丁二醇(2,3-butanediol)是一种平台化合物，在化工、食品、能源、医药等领域具有广泛的应用价值，其微生物发酵生产是现代生物化工的重要课题。2,3-丁二醇分子中含有两个手性碳原子，因此存在三种光学异构体，分别是(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇。单一构型的meso-2,3-丁二醇不仅具有混旋型2,3-丁二醇的基本功能，而且在不对称合成高附加值化学品和药物方面具有巨大的潜在优势，例如用于合成可再生聚酯或者光学纯卤代醇，具有广阔的应用前景。传统化学合成法获得的2,3-丁二醇是三种光学异构体的混合物，不但存在过程繁琐、产率低、环境污染严重等问题，而且由于不同立体构型2,3-丁二醇的物理化学性质相近，手性拆分成本十分高昂，难以实现大规模低成本生产。因此，开展微生物高效合成单一构型meso-2,3-丁二醇的研究具有重要的意义。

与传统化学合成法相比，2,3-丁二醇的微生物发酵法对环境友好，工艺简单，符合绿色化工的要求。目前2,3-丁二醇的高产菌种大多属于致病微生物，如Klebsiellapneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Serratia marcescens、Enterobacter cloaca，因此限制了这些菌株的产业化应用。另外，目前已报道的2,3-丁二醇发酵菌株所产的2,3-丁二醇多为两种或三种光学异构体的混合物【Biotechnol Adv,2011,29:351-364】，同样存在手性拆分、成本高昂的问题。目前尚未发现能够发酵生产光学纯meso-2,3-丁二醇的天然微生物。因此，迫切需要开发出meso-2,3-丁二醇的产量、转化率以及光学纯度高并且安全可靠的代谢工程菌株。

中国专利201410051821.8公开了克隆E.cloacae subsp.dissolvens的2,3-丁二醇合成基因簇，该基因簇包括四个基因，其中lysR编码2,3-丁二醇合成调控因子，budA、budB、budC编码α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、meso-2,3-丁二醇脱氢酶。将该基因簇插入表达载体pET-28a(+)获得重组质粒pETRABC，导入E.coli获得工程菌株。该工程菌株meso-2,3-丁二醇最高产量为85g/L，但光学纯度太低，仅为96％，而且为达到高产需要使用高价原料酵母粉和葡萄糖。此外，pET-28a(+)是高拷贝表达载体，而且该法需要诱导表达数量较多的基因(lysR、budA、budB和budC)，加大了宿主的代谢负荷，会增加大规模工业生产的不稳定性。而目前使用廉价碳源发酵生产meso-2,3-丁二醇的方法，则由于菌株的生产能力不足导致meso-2,3-丁二醇产量偏低，或者光学纯度达不到要求。综上所示，meso-2,3-丁二醇现有合成技术中存在原料成本过高、光学纯度太低，产量太低，或者菌株不稳定等问题。

发明内容