[发明专利]光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法及应用

权利要求书

1.一种光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因的核苷酸序列进行密码子优化；（2）将经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和meso-2,3-丁二醇脱氢酶基因拼接获得包含该三个基因的基因簇，所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；（3）将基因簇插入表达载体中，获得多顺反子重组质粒；（4）将多顺反子重组质粒导入宿主菌E. coli，即获得光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株；

所述宿主菌E. coli为多基因缺失的突变菌株，其通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得；所述副产物包括(2R,3R)-2,3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和甲酸；所述合成副产物的关键基因包括gldA、dar、frdABCD、ldhA、pta、adhE和pflB。

2.如权利要求1所述构建方法构建而得的基因工程菌株在生产meso-2,3-丁二醇的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）发酵培养基的制备：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化钙，在80-100°C液化0.5-5 h，静置冷却；当温度降低至55°C时，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60°C糖化5-20h，调节pH 6.5-7.5，离心或过滤收集上清液，稀释上清液后在115°C条件下灭菌15min，即得；按1000mL水计，所述发酵培养基各原料组分分别用量为：木薯粉100-200 g，氮源原料40-80 g，液化酶0.5-2 mL，氯化钙0.01-0.5 g，糖化酶0.2-1 mL，蛋白酶0.05-0.5 g；所述木薯粉是将木薯去皮晒干后经粉碎过50-200目筛制备而得；所述氮源原料为棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉、花生蛋白粉中的一种或两种以上组合；

（2）将发酵培养基转移至发酵罐，然后添加50-100 μg/mL氨苄青霉素，在无菌条件下，将经活化的基因工程菌菌液以体积比为2-10%的接种量接种至发酵培养基中，在温度35-40°C、搅拌转速200-600 rpm、通气量0.2-1.5 vvm条件下培养24-72 h，当检测发酵液中meso-2,3-丁二醇的浓度不再增加时，发酵结束。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述基因工程菌菌株的活化方法包括以下步骤：将光学纯meso-2,3-丁二醇高产工程菌株划线到含有质量体积比为1.5-1.8%琼脂和含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养10-15 h；在无菌的条件下，用牙签挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C摇床震荡培养10-15 h；所述的LB培养基配方为：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化钠。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在发酵过程中检测发酵液中葡萄糖的浓度，待葡萄糖浓度降至10-30 g/L时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为40-80g/L。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述木薯还原糖母液的葡萄糖浓度为500-800 g/L。