[发明专利]一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法

说明书

本发明公开了一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法，将α‑乙酰乳酸合成酶基因、α‑乙酰乳酸脱羧酶基因和NADH氧化酶基因的核苷酸序列进行密码子优化；拼接获得包含该三个基因的基因簇；将基因簇插入表达载体中，获得多顺反子重组质粒；再导入宿主菌E.coli，获得生产乙偶姻的基因工程菌株；将活化的菌株接种至含廉价原料的发酵培养基进行发酵培养，获得含有乙偶姻的发酵液；取发酵液进行离心处理，取上清液，再加入磷酸氢二铵，发酵产生的乙偶姻与NH₄⁺反应合成四甲基吡嗪。本发明提供的菌株能有效利用来源广泛、成本低廉的原料生产高浓度前体物质乙偶姻，氧化型辅酶NAD⁺能够有效再生，可提高乙偶姻产量和生产效率，从而有效降低四甲基吡嗪的生产成本，缩短生产周期。

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体是一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法。

背景技术

四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine)又名川芎嗪，是中药川芎根茎的主要活性生物碱成分，具有扩张血管、改善微循环、抑制血小板黏附聚集和血栓形成等良好的药理作用，在治疗心脑血管疾病、呼吸系统疾病和肾小球疾病等方面具有一定疗效，已作为常备药品广泛应用于临床。此外，四甲基吡嗪天然存在于乳制品、豆制品、可可、咖啡、花生、榛子、和白酒中，具有烘烤和坚果的特殊香味。四甲基吡嗪也是是中国白酒中的重要香气化合物，在中国传统白酒中均检测到一定量的四甲基吡嗪，其不仅对中国白酒风味有重要的贡献，而且还赋予了中国白酒有益健康的功能。四甲基吡嗪香味阈值极低，国家标准GB2760-1996规定其为允许使用的食用香料，目前广泛应用于烘烤食品、冷饮、肉类、乳制品、卷烟等香精的调配。

四甲基吡嗪的生产方法可分为植物提取法、化学法和生物合成法。利用萃取的方法可从中药川芎根茎中提取四甲基吡嗪，但是川芎植物来源有限，而且川芎根茎中的四甲基吡嗪含量较低，无法实现大规模的商业化生产。化学法合成四甲基吡嗪的反应条件一般较剧烈，对设备要求较高，普遍存在较严峻的环保问题，且产品不属于“天然”或“生物合成”范畴，安全性和品质问题正在受到不断的质疑。生物化工方法生产的四甲基吡嗪具有产品绿色天然、成本低、反应条件温和、环境污染小等优点，随着人们对绿色产品需求的日益提高，该法受到越来越多的关注。然而，由于利用微生物发酵生产乙偶因并将其转化为四甲基吡嗪的相关研究起步较晚，通过生物技术途径生产四甲基吡嗪的技术远未成熟。

中国专利201010238685.5公开了一种生产四甲基吡嗪的方法及其生产菌株，筛选的Bacillus subtilis XZ1124，Bacillus licheniformis BL-L1、MT-6和MT-15，利用葡萄糖为碳源、酵母膏为氮源时，在发酵罐中乙偶因积累量为30-44g/L，但周期长达72h，而且副产物的积累导致葡萄糖的转化率太低。发酵液离心取上清加入2倍相应乙偶姻摩尔浓度的磷酸氢二铵，在55-90℃水浴摇床(转速150rpm)反应20h，四甲基吡嗪的浓度为11-20g/L。该发明工艺较为简单，但所使用的菌种为野生型菌株，发酵过程中会积累各种副产物，降低了原料的转化率，进而影响了四甲基吡嗪的得率。微生物发酵生产乙偶姻时，糖酵解过程会产生的大量还原型辅酶NADH，而乙偶姻及四甲基吡嗪的产生并不能消耗NADH，因此微生物细胞会启动乳酸、乙酸、乙醇、丁二酸等副产物的合成途径来消耗过量的NADH，实现氧化型辅酶NAD+的再生，这些副产物的积累不但降低了原料的转化率和四甲基吡嗪产量，还会抑制微生物的生长和发酵。