[发明专利]一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法

权利要求书

1.一种利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和NADH氧化酶基因的核苷酸序列进行密码子优化；

（2）将经密码子优化的α-乙酰乳酸合成酶基因、α-乙酰乳酸脱羧酶基因和NADH氧化酶基因进行拼接获得包含该三个基因的基因簇；所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（3）将基因簇插入表达载体中，获得多顺反子重组质粒；

（4）将多顺反子重组质粒导入宿主菌E. coli，获得生产乙偶姻的基因工程菌株；所述宿主菌E. coli是多基因缺失的突变菌株，通过叠加敲除菌株中合成副产物的关键基因而获得；所述副产物包括2,3-丁二醇、丁二酸、乳酸和乙酸；所述合成副产物的关键基因包括gldA、frdABCD、ldhA和pta；

（5）对木薯粉、氮源原料进行水解，得发酵培养基，将活化的生产乙偶姻的基因工程菌株接种至发酵培养基进行发酵培养，获得含有乙偶姻的发酵液；

（6）取上述发酵液进行离心处理，取上清液，再加入磷酸氢二铵，在加热条件下，乙偶姻与NH₄⁺反应合成四甲基吡嗪。

2.根据权利要求1所述利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法，其特征在于：所述步骤（5）的具体操作步骤为：

S1：取木薯粉、氮源原料，再加入水、液化酶和氯化钙，在80-100℃下液化0.5-5 h，静置冷却；当温度降低至55℃以下时，加入糖化酶和蛋白酶，在50-60℃糖化5-20 h，调节pH6.5-7.5，离心或过滤收集上清，稀释上清液后在115℃条件下灭菌15 min，即得发酵培养基；按1000 mL水计，各组分的用量为：木薯粉100-200 g，氮源原料40-80 g，液化酶0.5-2mL，氯化钙0.01-0.5 g，糖化酶0.2-1 mL，蛋白酶0.05~0.5 g；所述木薯粉是将木薯去皮晒干后经粉碎过50-200目筛制备而得，所述氮源原料为棉籽蛋白粉、豆粕粉、豆饼粉中的一种或两种以上组合；

S2：在无菌条件下，在发酵培养基中添加50-100 μg/mL氨苄青霉素，然后移至发酵罐中，将经活化的生产乙偶姻的工程菌菌液以体积比为1-10%的接种量接种到发酵培养基中，在温度35-42℃、搅拌转速200-800 rpm、通气量0.5-1.5 vvm条件下发酵培养20-72 h，当检测发酵液中乙偶姻的浓度不再增加时，发酵结束，获得含有乙偶姻的发酵液。

3.根据权利要求2所述利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法，其特征在于：所述活化的生产乙偶姻的工程菌菌液的制备方法，包括以下步骤：

将生产乙偶姻基因工程菌株划线到含有质量体积比为1.8%琼脂和含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，在37℃培养10-15 h；在无菌的条件下，挑取LB平板上的一个单菌落，然后接种到含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体种子培养基中，37℃摇床震荡培养10-15 h；所述LB培养基的配方为：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化钠。

4.根据权利要求2所述利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法，其特征在于：在步骤S2的发酵过程中检测发酵液中葡萄糖的浓度，当葡萄糖浓度降至10-30 g/L时，补加木薯还原糖母液使发酵液中葡萄糖浓度为40-80 g/L；所述木薯还原糖母液的葡萄糖浓度为500-800g/L。

5.根据权利要求2所述利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法，其特征在于：所述步骤（6）的具体操作步骤为：将含有乙偶姻的发酵液离心，去除沉淀，取上清液测定乙偶姻的含量，然后加入乙偶姻1-2.5倍摩尔浓度的磷酸氢二铵，溶解后，调节pH至7.5，在65-95℃水浴摇床中反应6-20 h，即得四甲基吡嗪。

6.根据权利要求5所述利用廉价原料生产四甲基吡嗪的方法，其特征在于：水浴摇床反应过程中加入乙偶姻0.1-2倍摩尔浓度的过氧化氢。