[发明专利]一种FSH‑HSA融合蛋白及其制备方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及人类生殖领域，具体涉及一种FSH-HSA融合蛋白及其制备方法。

【背景技术】

促卵泡生成素(Follicle Stimulating Hormone，简称FSH)，是一种由脑垂体前叶嗜喊性细胞合成与分泌的高度糖基化蛋白，与脑垂体分泌的其他糖蛋白激素如促黄体激素(LH)、促甲状腺激素(TSH)，还有胎盘分泌的促绒毛膜激素(HCG)共同组成糖蛋白家族，都由α亚基和β亚基所组成，α亚基相同，而β亚基具有激素各自的特异性，是激素生物活性和免疫原性的决定因素。FSH的α亚基由92-96个氨基酸组成，β亚基由109-115个氨基酸组成。两亚基通过内部二硫键维持自身正确的三级结构，C端残基的位置决定其折叠的三维空间结构。根据Qing R.Fan等人在nature上发表的FSH与其受体的三维结构，FSH主要通过β亚基的C端与其受体结合，同时β亚基的C端通过内部二硫键的固定与α亚基紧密结合，其中真正与受体的结合位点是β亚基的C端第89-105位氨基酸，它像三明治一样，夹在α亚基的L2环和C端中间。女性卵泡颗粒细胞上含有FSH的特异性受体，雌激素协同FSH使颗粒细胞增生，内膜细胞分化，卵泡液形成，卵泡腔扩大，从而促进卵泡生长和发育成熟。卵泡在生长过程中会释放抑制素以阻断卵泡剌激素的进一步合成，并呈剂量依赖关系。这一机制保证了排卵的选择性。男性由细胞精管内的支持细胞是FSH的靶细胞，FSH与支持细胞上的特异性受体结合后将剌激由细精管上皮和次级精母细胞的发育，在LH和雄激素的协同下促进精子发育成熟。因为FSH对女性的卵泡成熟和男性的精子发育有非常重要意义，因而可以单独使用FSH或联合LH应用治疗不育不孕症。

FSH可以从脑垂体或绝经后的妇女尿液中分离得到，但尿源hFSH存在病毒污染、原料来源有限、采集困难、含量低及纯化过程复杂等问题，欧美等发达国家普遍不接受尿源产品上市和销售。FSH也可以重组生产(US5，639，640、US5，156，957、US4，840，896、EP211，894)，但仍然存在一些缺点。首先，其半衰期短。刺激女性卵泡发生需要连续8-10天，有时高达21天，而对于低促性腺激素的男性，诱导精子发生需要高达18个月。为达到临床效果，需每天肌肉注射或皮下注射给药，这样的给药方案经常伴有局部反应和不适，常见的并发症如卵巢过渡刺激综合征，变现为卵巢增大、全身毛细血管通透性增加和腹水形成，重者可危及患者生命。其次，目前重组hFSH表达量低，制备过程复杂和生产成本巨大。因而开发长效FSH，减少给药频率具有实际临床应用价值。

近年来有多篇专利及文章报道开发长效FSH，主要分为两类，一种是通过增加FSH的糖基化位点来达到提高半衰期的目的，另一种通过与Fc片段融合来提高蛋白体内半衰期。前者可再细分为两类，一种是在FSH分子内部增加糖基化修饰位点，如W001/58493公开了可以在FSH的α亚基进行的77种突变和可以在FSH的β亚基进行的51种突变，但其未公开其突变后的效果；另一种是在序列末端添加额外序列来增加糖基化修饰位点。目前开发比较成功的是2010年由德国默克公司上市的elonva，该类似物具有天然FSH的生物活性，但却具有较长的循环半衰期，在人体内的半衰期约69h。蛋白具体序列在专利US5，338，835和US5，585，345中公开，是一种改造的FSHβ亚基，其C末端谷氨酸以hCG的羧基末端肽(CTP)基团延长。

IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达到21天，而Fc片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，Fc片段可与新生Fc受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。因此，IgG的Fc片段被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白，以提高活性蛋白的体内半衰期，达到长效的目的。专利USO，186，662公布了通过构建FSH-FC融合蛋白同二聚体、异二聚体，在大鼠体内半衰期提高至60h。但该蛋白按三天给药一次，FSH已经代谢完毕没有活性。CN201210476665在此基础上加以完善，FSH融合蛋白的的β亚基直接或者间接通过链接元件linker融合在FC片段上，保留原有亲和力的前提下，增强了体内半衰期。但是其半衰期仍只有30-40小时(文献报道标准品重组FSH为12h)，且需达到同等效果剂量约为Gonal-F的十倍，用量大。CN201310529897介绍另一种FSH-Fc融合蛋白，该蛋白特征为β亚基链接CTP，α亚基链接Fc片段，α亚基通过共价键形式与CTP相连。此蛋白活性与重组FSH相当，但其半衰期也仍只有重组FSH的三倍左右。