[发明专利]一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法

权利要求书

1.一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：包括：

培养基制备；

接种体分离；

接种体鉴定；

接种体保存；

接种体复壮；

接种孢子制备；

鉴定设计；

鉴定材料准备；

对照品种选择；

接种以及接种后管理；

病情调查；

抗病性评价。

2.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：所述培养基制备包括制备水琼脂培养基以及制备马铃薯培养基：在制备水琼脂培养基中，以1L培养基为列：用5个250ml三角瓶每个装入200ml纯净水和4g琼脂粉然后加热至121℃，灭菌30min后取出，冷却后贮存备用，在制备马铃薯培养基中，以1L为列：称取马铃薯200g，切成细条或片状，放入锅中蒸煮当马铃薯煮至熟而不烂时，在1L量筒上用纱布过滤马铃薯残渣，定容至1L，用5个250ml三角瓶每个分别加入200ml滤液、4g葡萄糖、和4g琼脂粉然后121℃，灭菌30min后取出，冷却后贮存备用。

3.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：接种体分离的具体步骤为：从田间采集刚开始发病的辣椒炭疽病病果，在超净工作台上，用手术刀取0.5cm×0.5cm的病健部，先用75％酒精的消毒30s,再放入0.1％的次氯酸钠中浸泡2min，用灭菌水清洗3次后，用灭菌滤纸吸干病健块的水分，插入倒的水琼脂平板上，放置28℃人工气候箱中黑暗培养2d，待长出菌丝后再转接在PDA平板上，获得分离物。

4.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：接种体鉴定的具体步骤为：将培养7d后的分离物在显微镜下进行菌丝、孢子形态观察，如符合辣椒炭疽病病原菌的形态特征，用CTAB法提取分离物菌丝DNA，经过对获得的DNA进行电泳分析，分离物的DNA提取成功将分离物的DNA进行PCR扩增，扩增产物用1％琼脂凝胶电泳检测，将得到的rDNA ITS序列提交至GenBank,BLAST进行对比，如与辣椒炭疽病病原物的ITS序列具有99％的相似，即可确定是辣椒炭疽病病原菌。

5.根据权利要求4所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：用CTAB法提取分离物菌丝DNA的具体步骤为：将培养5～7d的分离物，用灭菌手术刀刮菌丝于一干净灭菌的1.5mL离心管中，加500μl TE缓冲液混匀，加入10％SDS溶液30μl和10mg/ml蛋白酶K(PK)3μl混匀，37℃水浴孵育1h℃水浴孵育1h，加入100μl Nacl(5M)混匀，加入80μl CTAB/Nacl混匀，65℃水浴10min，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min离心15min，取上清至新1.5mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)混匀，12000r/min离心15min，取上清至新1.5mL离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液混匀，12000r/min离心5min，取上清至新1.5mL离心管，加入2/3体积异丙醇，放入-20℃冰箱1h，12000r/min离心10min，去上清，用吸水纸吸干离心管口，沉淀用70％冷乙醇洗涤12000r/min离心10min，去上清，用吸水纸吸干离心管口，55℃干燥15min，加入20～50μl TE缓冲液溶解DNA沉淀，用1％的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和DNA，将混有上样缓冲液的DNA加至样品孔中，用DNA Maker做分子量的标记，进行电泳分析，电泳结束后，在凝胶成像分析仪下观察是否提取出DNA电泳带，拍摄并记录实验结果，经过对实验结果的观察，分离物DNA提取成功，剩下的DNA在-20℃保存。

6.根据权利要求1所述的一种辣椒炭疽病室内抗性鉴定方法，其特征在于：接种体保存的具体步骤为：将鉴定为辣椒炭疽病的病原菌，进行3次单孢分离纯化后，转接于含PDA斜面培养基的5cm冷冻离心管上，于28℃人工气候箱中黑暗培养3d，在斜面上加倒入一层1cm厚灭菌矿物油后置4℃或室温保存。