[发明专利]一种外源蛋白安全性的快速评价方法

说明书

本发明公开了一种外源蛋白安全性的快速评价方法。本发明通过将编码外源蛋白的基因克隆入pPICZb载体，得到外源蛋白表达重组载体转化毕赤酵母，得到表达外源蛋白的毕赤酵母；将表达外源蛋白的毕赤酵母每天灌胃啮齿类动物，连续90天；日常观察啮齿类动物的健康状态；90天末处理啮齿类动物，取肝、脾、心和肾组织，石蜡切片；免疫组化鉴定外源蛋白在组织器官中的分布以及病理切片分析各组各器官的炎症反应情况；依据炎症反应情况，判断该外源蛋白的安全性。本发明具有如下优点：高通量；可放大外源蛋白暴露浓度，缩短评估周期；可研究剂量与安全性关系；可研究蛋白活性与安全性关系。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种外源蛋白安全性的快速评价方法。

背景技术

基因(transgenic modified，GM)作物是农业领域的一项重要科技成果，对于粮食实现增产有重要作用。中国在棉花、水稻、玉米等作物的转基因研究方面已形成了自己的特色和优势。然而，由于目前转基因成份诱发的非预期效应不明确，安全评价结果争议大。目前全球商业化种植的转基因作物常见性状之一是抗除草剂，抗除草剂基因中以来源于土壤农杆菌(Agrobacterium sp.)CP4株系的epsps(5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphatesynthesis，cp4-epsps)合成酶基因的使用最为广泛，该酶对除草剂草甘膦有高抗性。随着基因工程技术的发展，也衍生出多种修饰的cp4-epsps转基因作物。由于该基因主要用于大豆玉米等食用性作物，伴随产生的食品安全问题也引起人们极大的关注。

目前该转基因作物食用性安全评价方法是由欧洲食品安全机构(European FoodSafety Authority,EFSA)提出，必须对啮齿类动物进行为期90天的喂食观察，如果90天内动物连续食用该转基因食物，其各项生理生化指标未显异常，则被认为安全(EFSA GMOWorking Panel.Safety and nutritional assessment of GM plants and derivedfoods:the role of animal feeding trials[J].Food and Chemical Toxicology,2008,46:S2–S70)。很多研究按照上述方法评价了多种转基因作物的安全性，结果显示“90天内无明显数据表明该转基因作物对鼠(猪)有害”。与此同时，另一些科学家在此基础上延长喂食时间或增加转基因成份CP4-EPSPS的浓度后发现，小鼠的淋巴细胞、肠抗感染能力、肝细胞代谢率等多项检测指标出现波动。Mesnage R等人于2017年发表的最新研究结果，他们将受试的SD大鼠分为三组，一组所喂饲料中未添加33％的Roundup NK603玉米(未喷洒除草剂NK603-R)，一组其饲料添加33％喷洒Roundup除草剂添加的NK603玉米(NK603+R)，另一组饲料中添加与NK603转化植株DK2678遗传背景接近的等基因系植株DK2675作为阴性对照，经过长达两年的观察发现，三组大鼠的肝和脾的代谢组数据中有七种代谢物浓度发生变化，但差异不明显，尚未确定这些变化是否与毒性相关(Mesnage R,et al.Transcriptome andmetabolome analysis of liver and kidneys of rats chronically fedNK603Roundup-tolerant genetically modified maize[J].Environmental ScienceEurope.2017,29(1):6.doi:10.1186/s12302-017-0105-1)。另外据调查发现(Han F,etal.Attitudes in China about Crops and Foods Developed by Biotechnology[J].PLoS ONE,2015,10(9):e0139114.doi:10.1371/journal.pone.013911；曲瑛德，陈源泉，侯云鹏,等.我国转基因生物安全调查I:公众对转基因生物安全与风险的认知[J].中国农业大学学报,2011,16(6):1-10)，国内消费者对转基因作物的最大担忧就是非预期效应。由此可见，改良转基因成份如CP4-EPSPS等的安全评价工作，减少争议结果是转基因作物安全性评价工作中最重要的一环。