[发明专利]在水稻基因打靶中识别特异位点的PL‑LbCpf1‑RVR基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种在基因打靶中识别特异位点的PL-LbCpf1-RVR基因及其在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

CRISPR/Cas基因编辑系统已成为植物功能基因研究和分子育种的重要手段。传统的CRISPR/Cas系统多使用Cas9蛋白作为核酸内切酶在植物基因组目标靶点造成定点切割，从而引入位点特异性突变。最近，从细菌中发现了另一种Cas蛋白Cpf1同样具有核酸内切酶活性。相对于Cas9蛋白， Cpf1在剪切原理和编辑模式上具有一些特点。例如：Cas9识别3’端富含胞嘧啶的PAM(Protospacer adjacent motif)序列，而Cpf1则识别5’端富含胸腺嘧啶的PAM序列；Cas9通常在PAM的5’上游的近端造成平末端DNA切割，而Cpf1在PAM的下游远端造成粘末端切割；Cas9只具有DNA剪切活性，而Cpf1既可以剪切DNA也可以加工RNA；Cas9在靶向编辑时需要一段较长的人工RNA序列，而Cpf1则只需要较短的crRNA序列即可完成靶向。

目前植物中最为常用的Cpf1来源于毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006的LbCpf1。LbCpf1可有效识别基因组中的TTTV (V＝A/C/G)序列作为PAM，从而靶向其下游序列。相对于Cas9识别的 NGG PAM，LbCpf1可编辑基因数量有限。

但是，目前还没有一种通用可行的提高LbCpf1可编辑位点数量并且能够保证LbCpf1基因在作物基因打靶中的突变效率的方法，而且现有的高突变效率的LbCpf1基因数量有限。因此，能够提供更多的在作物基因打靶中提供更多编辑位点的LbCpf1基因是人们迫切希望的，但是这样的基因往往是可遇而不可求的，没有成形的理论或方法能够为人们找到这样的基因提供理论依据。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种在作物基因打靶中识别特异位点的LbCpf1-RVR基因。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种新的PAM识别的 PL-LbCpf1-RVR基因，命名为PL-LbCpf1-RVR，所述PL-LbCpf1-RVR基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明的 PL-LbCpf1-RVR基因在水稻转基因培育过程中能够识别更多可编辑位点。

优选地，该基因由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列构成。相对于现有的LbCpf1基因而言，本发明所获得的PL-LbCpf1-RVR基因的编辑范围更宽。

在第二个方面，本发明提供一种含有所述PL-LbCpf1-RVR基因的植物表达载体。该植物表达载体的构建方法是利用NotI/SacI酶切位点，用 NotI/SacI酶切pHUN600载体并回收，由于合成的PL-LbCpf1-RVR序列两端加有NotI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将PL-LbCpf1-RVR连接到pHUN600载体，得到植物表达载体pHUN-RVRPL-LbCpf1-RVR(pHUN 6b11)。

另一方面，本发明在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的PL-LbCpf1-RVR基因。

另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述PL-LbCpf1-RVR基因完成水稻体内DNA双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有突变位点的转基因植物或植物部分。

在另一个方面，本发明提供一种利用pHUN-PL-LbCpf1-RVR(pHUN 6b11)表达载体(其含有所述PL-LbCpf1-RVR基因)，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(pHUN 6b11-DL)，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带PL-LbCpf1-RVR的打靶载体(pHUN 6b11-DL)的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入 2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；