[发明专利]在水稻基因打靶中识别特异位点的PL‑LbCpf1‑RVR基因及其应用

权利要求书

1.一种在水稻基因打靶中识别特异位点的PL-LbCpf1-RVR基因，其特征在于，所述PL-LbCpf1-RVR基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种RVR在水稻基因打靶中能够实现打靶的PL-LbCpf1-RVR基因，其特征在于，所述PL-LbCpf1-RVR基因包含序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的变体。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的PL-LbCpf1-RVR基因。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的PL-LbCpf1-RVR基因或权利要求3所述的表达盒。

5.一种权利要求1所述的基因、权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述PL-LbCpf1-RVR基因实现对水稻基因组的剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

6.一种利用含有权利要求1中所述的PL-LbCpf1-RVR基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组织；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触15分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述打靶载体，所述打靶载体中携带所述RVR在水稻基因打靶中识别特异位点的PL-LbCpf1-RVR基因；

(4)将步骤(3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)中所获得的苗转移到生根培养基中生根。

7.根据权利要求6所述的PL-LbCpf1-RVR基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，其特征在于，所述水稻是粳稻。

8.根据权利要求6所述的PL-LbCpf1-RVR基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，其特征在于，所述方法还包括对所获得水稻样品进行分子鉴定。

9.根据权利要求8所述的PL-LbCpf1-RVR基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，其特征在于，所述分子鉴定采用的PCR引物为5’-TTCACAACCGCGTTTACC-3’及5’-TCACCACCGCCTTCTTCT-3’。