[发明专利]基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法

说明书

本发明公开了一种基于磁固相微萃取‑碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法，采用磁固相微萃取对复杂生物基体样本进行净化，叶酸能猝灭氮掺杂荧光碳量子点的荧光，其猝灭的荧光信号强度与叶酸浓度呈一定线性关系，据此建立了检测叶酸的荧光分光光度法；本发明利用磁性纳米材料具有优异的分散性与生物相溶性，对荧光分光光度法中基体带来严重干扰的物质，采用磁性纳米材料作为吸附剂进行磁固相萃取净化，大大降低了基体的干扰，使测定结果的灵敏度、特异性、重现性得到很大提高。

技术领域

本发明涉及化学分析检测技术领域，更具体的是一种基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测生物样品叶酸的方法。

背景技术

叶酸(Folic acid, FA)是一种水溶性B族维生素，是维持生物体正常生命过程不可或缺的一类有机物质，对人体具有重要的生理机能。叶酸作为一种辅酶，对机体细胞分裂和生长以及造血机能有着密不可分的联系。叶酸来源于绿叶蔬菜，缺乏时可导致生理功能低下及某些疾病如巨幼红细胞贫血症、粒细胞减少、胃肠功能紊乱、智力退化等的发生，尤其是对孕妇、乳母及处于生长发育旺盛期的婴幼儿。一般正常人叶酸的需求量为200-400 µg/d，世界卫生组织建议成人至少为200 µg/d，孕妇和乳母为400 µg/d。

近年来，国内外研究学者对不同产品中叶酸含量的检测方法进行了深入的研究，现有对叶酸的检测方法主要包括分光光度法、微生物法、等离子发射光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等，在众多检测方法中，荧光分光光度法由于其简单、灵敏及成本低等优点，广泛用于体系中待测物质的分析检测。但荧光分光光度法的最大缺点是抗干扰能力差，当检测基体复杂时，干扰物质的影响尤为明显，主要表现在测定结果的准确性、重现性方面。基于碳量子点荧光分光光度法检测叶酸的方法已报道，但由于没有进行样品净化，干扰带来的影响并没有消除。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测灵敏、简单、样品萃取净化效果好、检测时间短的基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法。

本发明利用氨基三乙酸制备水溶性氮掺杂荧光碳量子点，叶酸对其产生荧光猝灭作用，在对样品血液及尿液中叶酸的检测中，通过进行磁固相萃取对样品净化处理与没有进行处理结果比较，无论从检测灵敏度、检出限及线性范围都得到很大的改善与提高。

本发明基于磁固相微萃取-碳量子点荧光猝灭检测叶酸的方法步骤如下：

(1)标准工作曲线的绘制：采用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配置8个浓度在0.05～30 µmol/L范围内的叶酸标准溶液，加入水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液，用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至5mL，涡旋混匀静置后，于荧光分光光度计上，激发波长为350 nm，发射波长为440 nm测定荧光强度，以荧光猝灭强度对其相应浓度作图进行回归分析，即得到标准工作曲线，由此得到叶酸的线性回归方程与其相关系数；

(2) 样品处理

血液样品：取5 mL新鲜血液，于以8000 r/min转速离心15-20 min，去除沉淀，并向上层血浆中加入1-2mL体积浓度10-15%的高氯酸溶液沉淀蛋白，于5000 r/min转速下离心10-15min，取上清液避光保存于4 ℃冰箱待分析测定；

尿液样品：取5-10mL尿液，加入1-3g活性炭，涡旋混合30-60s，静置过滤，取其滤液，避光保存于4 ℃冰箱待分析测定；

(3) 样品测定：取步骤或步骤处理过的样品，加入磁性纳米材料，涡旋使其充分混匀后，通过外加磁铁进行磁分离，弃去磁性纳米材料，取上清液1-2mL，向上清液中加入水溶性氮掺杂荧光碳量子点溶液，用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至5mL，涡旋混匀静置后，于荧光分光光度计上，激发波长为350 nm，发射波长为440 nm测定荧光强度，代入步骤(1)回归方程，计算出样品中叶酸的含量。