[发明专利]一种小反刍兽疫病毒HN蛋白抗原表位肽及其确定、制备方法和应用

权利要求书

1.一种小反刍兽疫病毒HN蛋白抗原表位肽，其特征在于：所述抗原表位肽的氨基酸序列为：

H123：¹²³KFLNPDREYDFRDLR¹³⁷；

或/和H185：¹⁸⁵GTGCLGRTVTRA¹⁹⁶；

或/和H487：⁴⁸⁷IRGPRGRCH⁴⁹⁵；

或/和H569：⁵⁶⁹ECFPWYHKVWCYHDCLI⁵⁸⁵。

2.根据权利要求1所述一种小反刍兽疫病毒HN蛋白抗原表位肽在小反刍兽疫病毒表位疫苗抗原和诊断试剂抗原制备中的应用。

3.根据权利要求1所述一种小反刍兽疫病毒HN蛋白抗原表位的确定、制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

计算模拟：

步骤一，用分子模拟软件构建虚拟HN蛋白头部3D结构：利用Discovery Studio V4.5对这两个目标蛋白——野毒株PPRV HN和疫苗株PPRV HN蛋白进行同源模建；其中PPRV Hw，GenBank登录号为FJ905304；PPRV Hv，GenBank登录号：X74443；

步骤二，搜索模板：搜索PDB数据库(www.pdb.org)，寻找通过实验解析出的同源蛋白的结构，选择序列一致性在30％以上，并且比对序列较长的蛋白结构作为模板结构，进行后续的计算；

步骤三，调整序列比对：选取模板蛋白之后，从PDB数据库中获得蛋白的空间坐标，将得到的模板蛋白序列与目标蛋白进行比对；

步骤四，建模：将比对结果提交服务器，根据模板蛋白的空间坐标和序列的相似性推测结构，从而计算得到目标蛋白结构，即每次模建生成至少5个不同的目标蛋白结构，要求PDF Total Energy较低的同时选择DOPE Score最低的模型进行后续计算；

步骤五，优化：采用CHARMm力场，先进行Steepest Decent优化5000步，再进行Conjugate Gradient优化2000步；

步骤六，评估结构：采用拉氏构象图分析方法评估蛋白结构的合理性，若位于不许可区的非甘氨酸/脯氨酸所占比例不超过5％，则说明模拟的蛋白结构是合理的，可以进行后续的计算分析；

基于免疫信息学的预测：

步骤一，PPRV-HN蛋白B细胞抗原表位预测：将PPRV HN蛋白的氨基酸序列用IEDB、Immunomedicine Group和BepiPred免疫信息学分析软件进行分析，综合分析预测其B细胞抗原表位；

步骤二，抗原表位的合成：将软件预测的抗原表位氨基酸序列送GeneScript公司用多肽合成仪合成，合成后用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析多肽合成的纯度及氨基酸的正确性；

抗体的制备；

步骤一，免疫动物：具有反应原性目的抗原rPPRV-HN-F和小反刍兽疫病毒糖蛋白(PPRV-Glycoprotein)免疫6-8周龄雌性Balb/c小鼠，颈背部皮下四点注射，免疫蛋白样品量为50μg/只，免疫体积200μL/只；首次免疫用等体积弗氏完全佐剂乳化，二次免疫和三次免疫用等体积弗氏不完全佐剂乳化；每隔14天免疫一次，三次免疫14天后小鼠断尾采血检测血清中的抗体，待抗体效价高1：10000后方可进行四免，四免不用佐剂，腹腔注射；

步骤二，多克隆抗体的纯化，将乙醚完全浸润的脱脂棉和小鼠同时放入麻醉盒，待小鼠完全失去知觉时，摘取眼球取学，收集完成后，将小鼠断颈处死，全血放37℃孵育30分钟后4℃过夜，4℃，1500rpm，离心15分钟，取血清，-20℃备用；

表位的鉴定：

预测的表位经过生物合成，鉴定符合实验要求，使用氨基化酶标板作为固相载体的间接ELISA方法进行；

稀释：将合成并冻干的表位肽用高压过的去离子水稀释成1μg/μL；

表位肽包被：将稀释好的表位肽包被在氨基化酶标板上，每孔50μL包被液，抗原的含量为5μg，4℃过夜；

洗板：将酶标孔里的液体尽可能甩尽，然后每孔加入约250μLPBST，静置3分钟，重复三次，最后将酶标板在纱布上拍干；

封闭：向酶标孔中加入1×封闭液150μL，37℃温箱孵育1.5小时后，将酶标孔里的封闭液尽可能甩尽，最后将酶标板在纱布上拍干后备用；

孵育一抗：用封闭液将单克隆抗体按1:500稀释，加入酶标板每孔50μL，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

孵育二抗：用封闭液将HRP标记抗鼠IgG二抗按1:5 000稀释，加入酶标板每孔50μL，放置37℃温箱中孵育1小时；

洗板：同上步洗板；

显色：每孔加入50μL TMB显色液，避光37℃孵育15分钟；

终止：每孔加入50μL终止液，终止显色；

读取：用终点法在波长450nm处对酶标板进行检测，读取OD450nm吸光度值；多表位抗原设计：

步骤一：设计多表位基因及诱导表达，将表位按照在天然蛋白中的顺序排列，表位之间加GS接头分子，送南京金斯瑞公司合成基因片段，连接到pET30a载体中；将载体转化到宿主菌中，按照培养温度37℃，诱导剂IPTG终浓度为1.0mM，氨苄青霉素LB培养基，诱导7小时进行诱导表达；

步骤二：多表位抗原的纯化

破碎菌体：将菌体反复冻融3次，用PBS缓冲液重悬菌体超声破碎；

离心：将破碎的菌体4℃10 000rpm离心20分钟，分别收集沉淀和上清；

样品准备：使用pH＝7.4缓冲液I重悬上步收集的沉淀，充分混匀，8 000rpm，4℃离心20分钟，取上清用0.45μm滤器过滤处理待上样；

平衡Ni柱：先在柱子底部加入少量去离子水排除空气，再装入2mL Ni-NAT填料，将装好的柱子用5倍体积的去离子水洗涤以去除乙醇，最后用5倍体积的pH＝7.4缓冲液I平衡柱材；

上样：将滤器过滤处理后的样品，分次与柱材结合，静置，待自然沉降，收集流湍液4℃环境保存；

洗涤：分次向柱子中加入pH＝7.4缓冲液I，总体积应大于上样量的5倍体积；洗脱：使用含有10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、300mM和400mM咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱蛋白，每个洗脱浓度静置15分钟，收集各浓度洗脱液置于冰上；

柱子保存：洗脱步骤完成后，用5倍柱材体积的pH＝7.4缓冲液I清洗柱子，加入适量20％乙醇4℃保存；

步骤三：多表位抗原的鉴定

蛋白电泳样品准备：取40μL蛋白上述步骤中分离的蛋白样品于1.5mL离心管中，再加入10μL 5×蛋白上样缓冲液，煮沸10分钟，置于4℃冰箱快速降温；上样及电泳：取10μL于12％SDS-PAGE中，100mV电泳；

转膜：将NC膜剪至与凝胶等量大小，并置于转移缓冲液中浸泡5分钟，按照从负极到正极的顺序分别放置厚滤纸、凝胶、NC膜、厚滤纸，注意应避免产生气泡，200mA恒流湿转100分钟；

封闭：取出转印后的NC膜，置于适量5％脱脂奶粉中，室温封闭两小时；

加一抗：将封闭完成的NC膜置于5％的BSA中，加入鼠抗His单克隆抗体按1:2500比例稀释和羊源小反刍兽疫阳性血清按1:250比例稀释，4℃冰箱过夜孵育；洗涤：一抗孵育完成后，用PBST摇动洗涤3次，每次10分钟；

加二抗：将NC膜置于兔抗鼠IgG-HRP按1:5 000比例稀释和驴抗羊IgG-HRP按1:25 000比例稀释二抗中，稀释液为含有5％脱脂奶粉的PBST，室温摇动孵育1小时；

洗涤：同上步洗涤；

显色：将洗涤完成的NC膜置于凝胶成像系统中，混合ECL超敏发光液A和B，滴在NC膜上室温孵育3分钟；

观察：调节不同的曝光时间，直到清洗看到明显的条带；

步骤四：免疫小鼠，将小白鼠分为5组，A组：PBS+弗氏不完全佐剂，B组：疫苗，C组：EHF1+弗氏不完全佐剂，D组：EHF2+弗氏不完全佐剂，E组：EHF3+弗氏不完全佐剂，每组12只小鼠，每只免疫蛋白50μL，免疫体积每只200μL，颈背部分四点皮下注射，21天后再次免疫；

步骤五：小鼠特异性抗体检测，0天、7天、14天、28天和35天断尾采血，37℃孵育30分钟，4℃过夜，3000rpm离心15分钟收集血清，储存于-80℃备用，用包被PPRV全病毒的间接酶联免疫法检测抗体水平；

步骤六：小鼠T淋巴细胞水平检测，检测免疫小鼠CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的增值情况，采用流式细胞技术检测免疫后0天，14天和26天外周血T细胞，在第35天检测脾脏中的T淋巴细胞，步骤如下：

采血：断尾采取小鼠抗凝血，每组采集5只小鼠，每只100μL；

抗体孵育：将采集的每只100μL抗凝血平均分成两份，其中一份加入APC Hamster Anti-Mouse CD3e抗体和PE Rat Anti-Mouse CD4抗体各2.5μL，FITC Rat Anti-Mouse CD8a抗体1μL；另一份加入APC Hamster IgG1,κIsotype Control抗体、PE Rat IgG2a,κIsotype Control抗体和FITC Rat IgG2a,κIsotype Control抗体各2.5μL，混匀后，避光4℃孵育15分钟；

裂解红细胞：加入1mL1×红细胞裂解液，混匀，避光室温孵育10分钟；

洗涤：加入1mL Hank’S液,混匀，1 000g离心5分钟，重复2次；

过滤：上样前用高压后的300目尼龙网过滤；

上样：将准备好的样品放在流式细胞仪上样架上，准备收集细胞。