[发明专利]一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法

说明书

本发明提供了一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法。具体地，本发明的方法可同时获得目标靶点和非目标靶点的扩增子，通过对扩增子建库和高通量测序可获得多个sgRNA靶点和脱靶位点的基因组切割效率，同时还能获知其Indel突变序列特征，从而快速、简便、全面而准确地评估sgRNA的活性和特异性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法。

背景技术

随着多种农业动物，如猪，牛和鸡等的全基因组测序完成，海量基因组信息可供基因功能和分子育种研究。基因功能研究方法有多种，如RNAi技术，转基因和基因敲除技术等。CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点编辑技术是第三代基因组编辑技术。CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列，clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA，阻止病毒感染。研究人员通过结合单分子成像和大量的生化试验，证实Cas9的基因组编辑能力是通过称作为“PAM”(protospaceradjacent motif)的短DNA序列来实现的。Cas9只有在识别PAM后才利用RNA–DNA碱基配对来切割靶DNA。

CRISPR/Cas9技术可实现多种基因组定点修饰，如基因敲除/敲入、单碱基突变、基因修复、条件性基因敲除和激活基因表达等。相比于传统基因修饰技术，它具有许多无可比拟的优点。首先，CRISPR/Cas9系统操作简单，核心作用元件为Cas9蛋白，只需设计靶向特定基因的sgRNA，即可修饰目标基因；其次，该系统在全基因组上可用的靶向结合位点很多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可用的CRISPR/Cas9编辑位点，可以说这一技术能对任一基因进行操作；再次，CRISPR/Cas9系统更具有可拓展性，例如可突变或修饰Cas9蛋白，使其不切断DNA双链，而只切开单链。利用paired-gRNA，可大大减低脱靶风险。此外，还可将Cas9蛋白上融合功能元件，激活目标基因表达。最重要的是，CRISPR/Cas9技术可同时实现敲除多个基因，可在大部分动、植物体内进行基因组编辑，而且实验时间周期相对较短，实验费用低廉。尽管CRISPR/Cas9技术存在一定的脱靶风险，但其实验操作简单，无物种限制，特别是对农业大动物开展功能基因组学研究提供了强有力的工具。

目前传统检测sgRNA活性的方法是T7EN1酶切法和克隆测序法，但该方法检测灵敏低，单次实验检测位点数量有限，相对检测成本较高。

因此，本领域迫切需要开发一种基于扩增子高通量测序技术评估sgRNA活性和特异性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于扩增子高通量测序技术评估sgRNA活性和特异性的方法，该方法主要将sgRNA靶点序列提取方法、扩增子高通量测序和数据分析方法进行有机结合，通过实验优化建立一种一步法评估多个sgRNA打靶和脱靶位点的新方法。

本发明第一方面提供了一种利用扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和/或特异性的方法，所述方法包括步骤：

(i)提供一待测样本，所述样本为基因组DNA样品，所述基因组DNA样品来自经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织；

(ii)对所述待测样本进行PCR扩增和纯化，获得扩增序列；

(iii)在T4多聚核苷酸激酶存在下，修复所述扩增序列的平末端；

(iv)对步骤(iii)所述的扩增序列，用接头序列进行接头连接；