[发明专利]一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法

权利要求书

1.一种利用扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和/或特异性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(i)提供一待测样本，所述样本为基因组DNA样品，所述基因组DNA样品来自经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织；

(ii)对所述待测样本进行PCR扩增和纯化，获得扩增序列；

(iii)在T4多聚核苷酸激酶存在下，修复所述扩增序列的平末端；

(iv)对步骤(iii)所述的扩增序列，用接头序列进行接头连接；

(v)补平对步骤(iv)所述的扩增序列的末端；

(vi)对步骤(v)获得的扩增序列进行Indexing PCR；

(vii)用高通量测序仪进行测序；以及

(viii)分析所述的测序数据，从而获得检测结果，所述检测结果包括：sgRNA的活性和/或脱靶位点切割效率。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中，还包括浓缩步骤，获得含有所述扩增序列的扩增产物浓缩物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织是在N种sgRNA引导下进行基因编辑的细胞或组织，其中，N为1-20，较佳地1-10，更佳地2-5。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

在步骤(viii)中，进一步地获得经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织中的Indel突变序列特征。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞或组织来自以下物种：人、非人哺乳动物、家禽、植物。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样本选自下组：血液、血浆、体液、尿液、皮肤、毛发、组织、或其组合。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中，所述扩增序列包括含有靶位点(on target site)和脱靶位点(off target site)的扩增序列。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的靶位点选自下组：DMD基因、ANPEP基因、hnRNPK基因、TP53基因、miR-21基因、CRYGC基因、MSTN基因、或其组合。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(viii)中，还包括步骤：将所述待测样本与所述对照样本进行比对，从而获得sgRNA的活性和/或特异性的步骤。

10.一种用于检测sgRNA的活性和/或特异性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i)靶位点(on target site)引物对，其中所述的靶位点引物对包括位于sgRNA所针对的靶位点上游的第一引物，以及位于所述靶位点下游的第二引物，从而用于扩增含靶位点的PCR扩增产物，即第一扩增产物；

(ii)脱靶位点(off target site)引物对，其中所述的脱靶位点引物对包括位于所述sgRNA的潜在脱靶位点上游的第三引物，以及位于所述脱靶位点下游的第四引物，从而用于扩增含所述脱靶位点的PCR扩增产物，即第二扩增产物；和(iii)接头序列，所述接头序列用于与所述的第一扩增产物、以及第二扩增产物进行连接，从而形成式II所示的连接产物：

L1－P－L2 (II)；

式中，

L1和L2各自独立地为接头序列；

P为第一扩增产物或第二扩增产物；

-表示化学键。