[发明专利]用于ESC向外胚层前体细胞分化的培养基和培养方法

说明书

本申请公开了一种用于ESC向外胚层前体细胞分化的培养基和培养方法。本申请的培养基包括分化培养基；分化培养基为RPMI‑1640培养基、DMEM/F12培养基或Knockout DMEM/F12培养基，其中含有第一、第二和第三试剂；第一试剂为终浓度30‑60ng/mL的Activin A或40‑80ng/mL的BMP‑4，第二试剂为终浓度1‑5μM的A83‑01，第三试剂为终浓度1‑8μM的PNU74654、1‑10μM的Dorsomorphin或0.5‑5％重量份的B‑27。本申请的培养基和培养方法，操作方便、成本低，能快速获得生长状态好、分化效率高的外胚层前体细胞，分化比例达到99％以上。

技术领域

本申请涉及胚胎干细胞分化培养领域，特别是涉及一种用于ESC向外胚层前体细胞分化的培养基和培养方法。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，缩写ESC)是从早期发育的哺乳动物胚胎或原始生殖细胞中分离得到的一类具有自我更新能力和分化全能性的细胞，在一定条件下可向内、中、外三个胚层的细胞分化，在新型药物筛选、细胞替代治疗以及再生医学研究中有巨大应用前景。

自从1998年Thomson等人成功建立起第一株人胚胎干细胞系以来，由于ESC出色的增殖能力以及几乎能分化为体内所有种类细胞的潜能而备受研究者的青睐。神经外胚层是神经系统发育的起源，也是早期哺乳动物胚胎发育的重要阶段，研究发现ESC能分化为功能神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞等神经类细胞，对帕金森症、肌萎缩性侧索硬化以及神经损伤等神经类疾病的研究与治疗有重大意义。ESC向外胚层前体细胞分化是形成神经外胚层的重要基础，因此，如何快速地从ESC中获得高纯度的外胚层前体细胞越来越受到科研工作者以及相关生物公司的重视。

目前主要通过ESC体外拟胚体培养和定向诱导分化两种方法得到外胚层前体细胞。其中，拟胚体培养的方法需要耗费大量时间，操作过程复杂，并且分化效率低。定向诱导分化的方法需要用到多种细胞因子组合，分化培养基成分复杂，成本高昂，不利于大规模使用。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养基和培养方法。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养基，该培养基包括分化培养基；分化培养基的基础培养基为RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基或Knockout DMEM/F12培养基，并且，分化培养基中含有第一试剂、第二试剂和第三试剂；第一试剂为终浓度30-60ng/mL的Activin A或终浓度40-80ng/mL的BMP-4，第二试剂为终浓度1-5μM的A83-01，第三试剂为终浓度1-8μM的PNU74654、终浓度1-10μM的Dorsomorphin或终浓度0.5-5％重量份的B-27。

需要说明的是，本申请的胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养方法包括三个培养步骤，即饲养层培养、无饲养层培养和分化培养；因此，相应的培养基也应该是由三种培养基组成的，即饲养层培养基、无饲养层培养基和分化培养基；其中，分化培养基是直接影响胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的培养基，因此，本申请经过大量的试验和研究提出了一种新配方的分化培养基，按照本申请的培养方法和本申请的分化培养基，胚胎干细胞向外胚层前体细胞分化的比例可以达到99％以上，大大优于以往的方法和分化培养基。并且，本申请的分化培养基，成份相对简单，成本低，利于大规模生产和使用。

可以理解，饲养层培养和无饲养层培养都可以参考使用现有的培养基，但是，为了达到更好的分化培养效果，本申请的优选方案中，对饲养层培养基和无饲养层培养基也进行了特别限定，这将在以下的方案中详细说明。

优选的，分化培养基的基础培养基为RPMI-1640培养基，第一试剂为终浓度30-60ng/mL的Activin A，第三试剂为终浓度1-10μM的Dorsomorphin。