[发明专利]来源于积雪草的蛋白及在制备山楂酸和科罗索酸中的应用

说明书

本发明公开了一种来源于积雪草的蛋白及在制备山楂酸和科罗索酸中的应用。本发明所提供的蛋白为如下任一：A1)氨基酸序列为序列1的蛋白；A2)将序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；A3)与以上所限定的氨基酸序列具有99％、95％、90％、85％或80％以上同源性且具有相同功能的蛋白；A4)在以上任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。实验证明，CaMAA45能以齐墩果酸和/或乌索酸为底物制备山楂酸和/或科罗索酸，可以利用CaMAA45及其编码基因制备山楂酸和科罗索酸，还可以利用CaMAA45催化三萜2位α‑羟化。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于积雪草的蛋白及在制备山楂酸和科罗索酸中的应用。

背景技术

山楂酸(Maslinic acid)(式1)、科罗索酸(Corosolic acid)(式2)和积雪草酸(Asiatic acid)(式3)等为代表的2位α-羟化药用三萜类活性成分均是山楂(Crataeguspinnatifida Bunge)，枇杷(Eriobotrya japonica)，大花紫薇(Lagerstroemia speciosa(L.)Pers.)和积雪草(Centella asiatica(L.)Urb.)等药用植物自身合成的微量次生代谢物，山楂酸与科罗索酸均为五环三萜酸，分属于β-香树脂型或α-香树脂型五环三萜类化合物，山楂酸与科罗索酸为同分异构体，在植物体内，二者常常共同存在。山楂酸、科罗索酸和积雪草酸在抗癌，抗艾滋病毒，美容及肝脏保护等领域有广泛应用，已作为营养补充剂或化妆品在市场上流通。目前这类化合物主要是从山楂，大花紫薇、枇杷等植物中分离提取得到，但这种方法有较多的缺点，包括含量低和差异大，产品纯化难，植物生长周期长，对生物资源尤其野生资源造成严重破坏等。

利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(Parayil Kumaran Ajikumar et al.,2010,Science,330:70-74)；银杏内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/L的产量(Effendi Leonard et al.,2010,PNAS,107(31):13654-13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸(Artemisinic acid)最高达到25g/L(Paddon CJ et al.,2013,Nature,2013,496:528-532)；目前国内在青蒿素，紫杉醇，人参皂苷和丹参酮等药物分子的生物合成方面有相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于积雪草的蛋白及在制备山楂酸和科罗索酸中的应用。

本发明所提供的来源于积雪草的蛋白质具有羟化酶功能，其名称为山楂酸/科罗索酸相关蛋白(CaMAA45)，具体可为如下任一：

(A1)氨基酸序列为序列表中的序列1的蛋白质；

(A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)或(A2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列