[发明专利]一种直接同时检测α与β地中海贫血的芯片、扩增试剂及试剂盒

说明书

本发明“用于直接同时检测α‑地中海贫血和β‑地中海贫血突变位点的芯片、扩增试剂及试剂盒”，属于分子诊断技术，其特征在于，基于直接多重PCR、Gap‑PCR和反向点杂交相结合的检测原理，根据各基因型的突变或缺失位点设计相应的扩增引物和探针，以生物素标记引物，以氨基标记探针，并以基因芯片为基底，将探针固定在DNA芯片上，通过特异性引物扩增出来的PCR产物与探针进行杂交，以信号显色盒判读来进行地贫的诊断。

技术领域

本发明涉及α与β地中海贫血的分子诊断技术，特别是涉及一种直接PCR(DirectPCR)结合杂交技术同时检测6种α地中海贫血突变和19种点突变β地中海贫血的试剂盒。

背景技术

地中海贫血(Thalassemia，简称地贫)是全球最常见的遗传病之一，其成因是血红蛋白(hemoglobin,Hb)四聚体组成的珠蛋白链的一条或多条肽链合成的减少或缺失。根据成人主要珠蛋白链(α₂β₂)所涉及的类型，该病被分为α-地贫和β-地贫。受累个体主要源于地中海地区、中东、外高加索、中亚、印度次大陆、东南亚和东亚，在我国长江以南如广东、广西、海南、台湾等地发病率高，大多以无明显症状的携带者形式广泛存在，受累人口超过2亿。据现有流行病学调查资料显示，以上地区人群中α地贫发生率高达4-15％；β地贫约1-6％。

α-地中海贫血(以下简称α-地贫)是最主要的地贫类型，编码α珠蛋白链的基因是16号染色体短臂末端的α珠蛋白基因簇。由于α-珠蛋白基因缺失或点突变而致α-珠蛋白链合成障碍的疾病，具高度的遗传异质性。就人类正常基因组而言，正常个体每条染色体上均有2个α珠蛋白基因(α2基因和αl基因)，所以每个正常人均有4个α基因，一个α基因缺失者，称α地贫(即-α/αα),2个α基因均缺失者，为α⁰地贫(即--/αα)。根据造成α地贫的分子基础可将α地贫分为缺失型和非缺失型；95％以上为缺失型，是由于α珠蛋白基因大片段缺失所致。目前全球至少发现了35种缺失，,我国最常见的为--^SEA、-^3.7和-^4.2缺失型突变。(2)非缺失型α地贫主要是由α珠蛋白基因点突变所致。目前全球已报道至少有46种的非缺失型α地贫的点突变类型。我国最常见非缺失型α地贫主要是Hb WS,Hb QS与Hb CS等点突变。在α地贫发病率最高的广西有45.8-53.3％的Hb H病患者携带其非缺失型α地贫。这类病人比那些缺失3个α珠蛋白基因所表现出更严重的临床症状。当夫妇双方均为她中海贫血基因缺失携带者时，其后代有25％的机会罹患Hb Bart's或HbH病。HbH病患者中至重度贫血，可丧失劳动力，严重影响生存质量；Hb Bart's水肿胎受累患儿因严重缺氧而胎死腹中或一出生即死亡，引起的产科并发症给产妇带来极大的身心伤害。这些都给家庭和社会造成巨大压力。

β地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一，在我国南方各省区高发，高发区人群基因携带率达到3-9％。β珠蛋白基因簇位于人体11号染色体的短臂上，包括ε、Gr、Ar、δ和β珠蛋白基因及2个假基因，总长度约为50kb；β珠蛋白肽链是由β珠蛋白基因所编码的146个氨基酸组成。β地中海贫血的主要分子病理学基础是β珠蛋白基因的点突变及小的插入或缺失，包括β珠蛋白基因的启动子序列突变或增强子突变都可引起β珠蛋白生成障碍性贫血,导致β珠蛋白基因转录、hnRNA加工或mRNA翻译异常引起，而相对过剩的α珠蛋白肤链的存在是β地中海贫血发生溶血、贫血和无效造血的根本原因。β珠蛋白基因含2个内含子及3个外显子。在其外显子1、外显子2、内含子1及3’端调控区集中了中国人群中发现的大部分突变。目前在全世界己报道约170种左右的β珠蛋白基因的突变类型，我国己发现至少有28种此类突变，最主要的有6种CD41-42，CD17，IVS-2nt654,TATAbox-28,CD71-72及CD26占中国人β地中海贫血突变基因总数的90％以上。β地中海贫血的纯合子或或β⁰β⁺的双重杂合子为致死性疾病。