[发明专利]一种对虾健康状况指示菌群的筛选方法

说明书

本发明公开了一种基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法，特点是基于生物信息学筛选对虾健康状况指示细菌门，并基于对虾肠道菌群组成特征设计特异性引物；采用实时定量PCR检测健康指示细菌门相对丰度，以健康指示细菌门相对丰度及其指示权重为自变量自建预测模型实现对虾养殖病害定量预测，优点是区分了不同生长阶段和病害对肠道菌群的影响，提高了预测的准确率，同时建立了廉价的定量预测病害方法，具有很高的实际应用价值，能够为制定应对干预措施提供依据，如设计益生菌群，对于降低对虾养殖风险起到良好推动作用。

技术领域

本发明涉及水产养殖病害预测方法，尤其是涉及一种基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法。

背景技术

对虾养殖模式从土塘养殖转变为集约化、高密度的温棚和循环水养殖，这种转变导致应激原增多、对虾免疫力下降, 致使对虾养殖病害频发。对虾病害具有发病快、死亡率高等特点，而目前缺乏特别有效的治疗方法。在对虾病害发生情况未见明显好转，部分地区有加重趋势的背景下，2016年农业部为对虾重大病害防治工作专门制定了方案，其中核心环节是在疾病诊断和环境监测的指导下安全合理用药。因此，亟需明确对虾病害的病因学机理，并建立定量预测对虾发病风险的技术，为采取针对措施防控病害提供依据和指导。

现有研究表明，肠道微生物通过拮抗病原菌定殖和促进宿主免疫力等，在维持宿主健康方面起到重要作用。对虾缺乏获得性免疫系统，主要依靠非特异性免疫因子抵抗环境胁迫和各种病原菌感染，因此正常和稳定的肠道菌群组成和功能在对虾健康中的作用可能更加突出。微生物能够对外界环境扰动(如水质恶化、病原菌侵染)做出线性(变异幅度与扰动强度在一定范围正相关)的响应，能够综合地反映环境和生物因素干扰的协同或拮抗效应。现有研究利用高通量技术发现健康和发病对虾的肠道细菌群落组成差异显著，并能够筛选出与病害严重程度线性相关的指示种群。然而，高通量测序技术存在周期长，费用昂贵和专业技术要求高等特点，难以应用于养殖过程中对对虾病害进行常规评估和预警。因此，急需建立一种廉价、快速、准确和定量的方法来克服现有技术的限制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种低成本、快速、定量预测对虾发病风险的基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于肠道指示细菌的对虾病害定量预测方法，包括以下步骤：前期采用Illumina高通量测序方法分别获得不同生长阶段健康对虾在和发病对虾的肠道细菌群落组成和丰度信息，先以虾龄为主因子利用随机森林模型筛选出健康对虾在不同生长阶段的特征细菌种群，定义为虾龄指示菌群；在肠道细菌群落组成中删除虾龄指示菌群后，以健康状况为主因子筛选出对虾健康状况指示菌群；针对对虾肠道菌群的组成特点，设计健康状况指示菌群的特异性引物，通过定量PCR检测获得健康状况指示菌群的相对丰度，以健康状况指示细菌群的相对丰度及其指示权重为为自变量，建立预测模型，利用预测模型定量预测对虾发病概率。

所述的对虾健康状况指示菌群的筛选方法具体步骤如下：

(1) 设共有N个样品，其中有a个健康和b个病害样品，前期所有样品通过Illumina高通量测序获得准确完整的细菌门组成，共得到m种细菌门，计算每个细菌门的相对丰度；

(2) 选取a个健康样品的细菌门群落，以每一个细菌门的相对丰度与所对应样品的虾龄进行随机森林计算，结合10倍交叉验证鉴定出与健康对虾虾龄显著相关的菌群，从而确定虾龄指示菌门的组合；

(3) 在m种细菌门中去掉步骤(2)中筛选到的虾龄指示菌门，且仅保留与b个病害样品相同虾龄的健康对虾样品的细菌门群落，以对虾健康状况为主变量，利用随机森林模型结合10倍交叉验证筛选出对虾健康状况指示菌群。