[发明专利]一种特异靶向猪IRS1基因的sgRNA导向序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种sgRNA导向序列及应用。

背景技术

IRS-1为主要的胰岛素受体底物，通过自身磷酸化作用将胰岛素信号向下各级传递、发散，从而诱导个体系统的生长以及影响葡糖代谢。IRS-1分布于全身各组织细胞中，主要在骨骼肌中表达。目前研究认为IRS-1的表达可能与具有Ⅱ型糖尿病家族史的患者密切相关，IRS-1表达不足或者磷酸化异常可导致胰岛素抵抗。Katsutaro Morino等人的研究表明，在这类糖尿病患者中，IRS-1的Ser312、Ser136磷酸化水平提高了50％，Akt的磷酸化水平下降60％，导致的结果是患者骨骼肌细胞葡萄糖摄取量比对照组低60％，线粒体密度低36％，脂类密度却高60％，呈明显的胰岛素对抗状态。基因水平研究认为：编码IRS-1的基因P512A(P513A,rs1801276)和G971R(G972R,rs1801278)变异导致了 IRS-1的磷酸化水平异常，而这种变异是否为具有Ⅱ型糖尿病家族史的患者所特有，携带这种突变基因的病人的糖尿病发病风险是否会显著增高还存在争议。Eleftheria Zeggini的统计实验认为这两处基因突变和糖尿病发生没有显著联系。目前的动物实验也说明他的结论是正确的，不仅是突变，甚至是敲除IRS-1基因的小鼠也仅仅表现出对胰岛素的抵抗，而不会表现出高血糖的症状，但如果胰岛β细胞不能分泌足够的胰岛素(细胞损伤)，小鼠就会表现出糖尿病症状。IRS-1基因是胰岛素受体与胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factors 1,IGF1)受体的重要底物，为了验证体内IRS-1基因的生理作用，基因打靶产生了IRS-1-/-基因型小鼠，IRS-1-/-小鼠能够以正常比例出生，但是它们的胚胎发育以及出生后发育明显迟缓，即使表现出一定的胰岛素抵抗现象，但是总体的血糖水平能够正常维持。将IRS-1敲除之后，下游的PI3K的活力并没有下降，有其它的物质能够与 p85亚基结合，这证明了IRS-1虽然是胰岛素信号通路中重要的受体底物，但是不依赖 IRS-1的信号通路在2型糖尿病发病中起到重要作用。

CRISPR技术被证明是进行哺乳动物基因组操作的有效的方法。在这个系统中，一个短RNA可以介导Cas9核酸酶准确的切割降解所匹配的DNA位点。与以往的基因打靶载体不同，CRISPR/Cas9系统只需20个碱基的sgRNA序列即可准确介导基因的敲除。这大大简化了基因打靶载体的构建过程。同时，因为短片段比较容易合成制备，通过这个技术已经制备多位点突变的细胞系和基因敲除鼠。对于功能基因的研究，敲除或干扰单个基因往往是看不出表型上的改变的，经常是需要对多个基因同时进行突变。2013年，张峰实验室利用CRISPR/Cas9系统实现了对小鼠胚胎干细胞Tet1、2、3、Sry、Uty-8五个基因的同时突变，并通过合子注射Cas9及sgRNA的mRNA实现了Tet1、Tet2双基因突变，获得成活的个体；Li-En Jao也在斑马鱼上实现了五个色素基因的同时双等位基因突变，获得成活的个体，并呈现出色素缺陷的表型；周琪课题组也利用同样的方法实现了大鼠的Tet家族三个基因的单基因及多基因的敲除，并且产生的突变可以通过生殖细胞传递给下一代；2014年Yuyu Niu，通过短尾猴合子期注射Cas9及sgRNA的mRNA实现了Ppar-γ以及Rag1的双基因突变。此外，人们不仅能够针对编码蛋白基因进行突变，还可以针对非编码区进行特定区域的基因突变，用于研究非编码区的功能。目前，利用 CRISPR/Cas9系统已经实现了在不同的物种中进行单基因、多基因突变，大大加快了基因功能研究进程。

发明内容

本发明目的在于提供一种特异靶向猪IRS1基因的sgRNA导向序列及其应用，该 sgRNA导向序列可以用于敲除猪IRS1基因，为制备转基因猪奠定基础。

本发明特异靶向猪IRS1基因的sgRNA导向序列为IRS1-SgRNA1，其核苷酸序列为： 5’-CGTAGTACTCGAGGCGCGCG-3’，如SEQ ID NO：1所示，位于基因IRS1的外显子 1。

上述特异靶向猪IRS1基因的sgRNA导向序列在敲除猪IRS1基因中的应用，具体方法如下：

一、在猪IRS1基因的sgRNA导向序列的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸；同时根据导向序列获得得其对应的DNA互补链，并且再起5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；