[发明专利]基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及一种基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法。

背景技术

FOXP3是调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的特征性标志，在维持免疫耐受过程中发挥重要作用。近年来研究证实：FOXP3基因的表达和蛋白功能的发挥均与表观遗传学(如DNA甲基化、翻译后修饰等)密切相关。亚硫酸氢盐测序法是国内外学者公认的脱氧核糖核酸(DNA)甲基化位点检测金标准，可准确而灵敏地检测出特定DNA序列不同胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)位点的甲基化状态，但是受实验过程中诸多因素(如样本保存条件、基因组DNA含量及纯度、转化后基因组DNA含量、PCR反应体系、甲基化引物序列、蓝白克隆筛选等试验因素)的影响成功率低下。

发明内容

本发明建立了一种基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3(forkhead/winged helix transcription factor,FOXP3)基因甲基化检测方法。

作为本发明的一个方面，提供了一种基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，包括：

步骤1，用促凝采血管收集人静脉血4mL，室温凝固30min，离心1000g×15min，而后分装1mL血凝块进1.5mL Axygen PE管，保存于-80℃冰箱中。

步骤2，采用血液基因组DNA提取试剂盒提取血凝块基因组DNA。

步骤3，通过0.8％-1.0％的琼脂糖凝胶电泳初步确定基因组DNA完整性、浓度和纯度，并将检测合格的DNA样本置于-20℃冰箱备用。

步骤4，采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA，并将修饰好的DNA样本置于-20℃冰箱备用。

步骤5，在确定的实验条件下进行甲基化PCR扩增，通过2％琼脂糖凝胶电泳(130V，40min)鉴定PCR产物，凝胶成像系统观察、拍照，并将回收完毕的目的PCR产物置于-20℃冰箱备用；所述确定的实验条件是：PCR模板量为10μL转化后的基因组DNA，PCR采用50μL反应体系和4μL的25mmol/L MgCl₂，扩增产物长度为111bp。

步骤6，PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳(130V，40min)鉴定，凝胶成像系统观察、拍照。

步骤7，采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收步骤5中的18μL PCR产物，通过载体连接将2μL PCR纯化回收产物转化入Trans1-T1感受态细菌中，开展蓝白克隆斑筛选，并以通用引物(M13F和M13R)做PCR扩增，产物经2％琼脂糖凝胶电泳(130V，40min)分离，凝胶成像系统观察、拍照，以鉴定阳性克隆。

步骤8，选取步骤7中阳性克隆斑中的菌体接种于50μg/mL卡那霉素单抗LB液体培养基中，在37℃恒温200rpm/min震荡培养8-12h后，取变浑浊的样本送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序部进行测序。

优选地，所述步骤5中进行PCR扩增的引物序列为：

F:5’-ATTTTTAGGATTTGAGGTTTTAATA-3’，

R:5’-CAAAAAACCCACTAAAAAACTATAC-3’。

优选地，所述步骤5中进行甲基化PCR扩增时的反应条件为：

步骤A，94℃预加热3min；

步骤B，94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min；

步骤C，重复上述步骤B中的循环35次；

步骤D，72℃保持7min后，4℃保存。

优选地，所述步骤5所确定的PCR实验体系为：4μL的25mmol/L MgCl₂。

优选地，所述步骤1中的血液采集方法为用促凝采血管收集人静脉血。

优选地，所述步骤1中收集的静脉血在室温凝固30min，离心1000g×15min，而后分装1mL血凝块进1.5mL Axygen PE管。

优选地，所述步骤1中的血凝块保存条件为：-80℃冰箱。

优选地，所述步骤2中的DNA提取试剂盒为：北京市天根生物有限公司血液基因组DNA提取试剂盒(货号：DP348)。

优选地，所述步骤3中的初步确认基因组DNA完整性、浓度和纯度的方法为：0.8％-1.0％的琼脂糖凝胶电泳法(130V，40min)。

优选地，所述步骤3中检测到的基因组DNA浓度为：5-20ng/μL。

优选地，所述步骤3中基因组DNA保存条件为：-20℃冰箱。