[发明专利]基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法

权利要求书

1.一种基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，其特征在于，包括：

步骤1，用促凝采血管收集人静脉血4mL，室温凝固30min，离心1000g×15min，而后将1mL血凝块分装进1.5mL Axygen PE管，保存于-80℃冰箱中；

步骤2，采用血液基因组DNA提取试剂盒提取步骤1中血凝块基因组DNA；

步骤3，通过0.8％-1.0％的琼脂糖凝胶电泳初步确认步骤2中的基因组DNA的完整性、浓度和纯度，并将检测合格的DNA样本置于-20℃冰箱备用；

步骤4，采用甲基化转化试剂盒修饰基因组DNA，并将修饰好的DNA样本置于-20℃冰箱备用；

步骤5，进行甲基化PCR扩增，通过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，凝胶成像系统观察、拍照；

步骤6，采用DNA纯化回收试剂盒纯化回收步骤5中的18μL PCR产物，通过载体连接将2μL纯化回收后的PCR产物转化入Trans1-T1感受态细菌中，开展蓝白克隆斑筛选，并通过通用引物(M13F和M13R)做PCR扩增，产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察、拍照，以鉴定阳性克隆；

步骤7，选取步骤6中阳性克隆斑中的菌体接种于50μg/mL卡那霉素单抗LB液体培养基中，在37℃恒温200rpm/min震荡培养8-12h后，取变浑浊的样本进行测序。

2.根据权利要求1所述的基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤5中进行PCR扩增的引物序列为：

F:5’-ATTTTTAGGATTTGAGGTTTTAATA-3’，

R:5’-CAAAAAACCCACTAAAAAACTATAC-3’。

3.根据权利要求1和2所述的基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤5中进行甲基化PCR扩增时的反应条件为：

步骤A，94℃预加热3min；

步骤B，94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min；

步骤C，重复上述步骤B中的循环35次；

步骤D，72℃保持7min后，4℃保存。

4.根据权利要求1所述的基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤3中的初步确认基因组DNA完整性、浓度和纯度的方法为：0.8％-1.0％的琼脂糖凝胶电泳法(130V，40min)。

5.根据权利要求1所述的基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤5的PCR产物鉴定方法：2.0％的琼脂糖凝胶电泳法(130V，40min)。

6.根据权利要求1所述的基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤6鉴定阳性克隆的方法为：通过通用引物(M13F和M13R)做PCR扩增，产物经2％琼脂糖凝胶电泳法(130V，40min)鉴定。

7.根据权利要求1所述的基于亚硫酸氢盐测序法的FOXP3基因甲基化检测方法，其特征在于，所述步骤7阳性克隆培养条件为：在50μg/mL卡那霉素单抗LB液体培养基中37℃恒温200rpm/min震荡培养8-12h。