[发明专利]高效合成融合基因的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因合成技术领域，具体涉及一种高效合成融合基因的方法及其应用。

背景技术

当前基因合成主要的方法为两步合成法，第一步是利用PCR(聚合酶链式反应)的方法将引物拼接形成200～800bp(碱基对)的小片段，经过测序验证无误后通过将片段拼接成更长的所需片段。常用的将小片段拼接成长片段的方法有连接法，重叠PCR方法，体外重组法等。目前应用最广泛的是重叠PCR的方法。在该方法中，两个需要拼接的片段有一个重叠区，可以用于重叠PCR反应时的退火。而在片段的另外两端分别设计扩增全长的引物，在PCR反应体系中，一个片段将可以利用另外一个片段作为模板延伸，从而得到拼接后的全长的片段序列，而最后扩增全长的引物将整个的全长片段进行扩增得到足够量以进行后续的克隆工作。

重叠PCR反应的成功与否是得到全长拼接片段的关键。由于目前对重叠PCR反应的影响因素并没有系统的研究与优化，因此重叠反应在日常拼接中的成功率并不高，大约在80％左右。而大部分的优化集中在对重叠PCR反应体系的改变上面。比如使用不同供应商、不同特性的聚合酶；在反应的缓冲液体系中加入不同浓度的镁离子；使用不同对的退火温度等。这些方法没有一个明确的指导原则，没有明确的优化参数可以进行方向性的判断，基本上是一个试错的过程，因而费时费力。

发明内容

本发明提供了一种合成融合基因的方法，包括如下步骤：S1：分析待合成融合的基因序列，确定适合进行退火的区域；S2：在适合进行退火的区域中选择合适长度的片段，进行各个片段的引物的设计与合成；S3：混合合成的各个片段的引物，然后进行重叠PCR，将各个片段的引物拼接成，得到拼接产物。需要说明的是，S3中，引物分离纯化后可以进行克隆测序后验证。为了提高片段之间的退火效率，从而提高片段的拼接成功率，本发明针对影响退火的序列进行了分析、结合PCR引物的设计原则来优化片段的分段原则。从PCR引物的设计原则借鉴中发现以下因素同样影响待拼接片段之间的重叠区域的有效性：(1)碱基的比例，也就是重叠区中AT与GC的比例，理想的情况下保持AT与GC的比例在接近1：1有利于片段的退火；(2)区域中复杂的二级结构区域，包括回文区与重复区域等，这些复杂二级结构影响有效的退火；(3)存在过多的连续碱基，比如类似AAAAAAAA等的连续区域。目前该领域的多种常用分子生物学软件均能分析目的序列并能发现以上的这些序列特征，比如Primer3、Oligo、DNAStar等商业化或开源的免费工具，均能用于发现上述不利的序列因素，从而在后续的拼接片段分段中通过项目设计者来主动避免，因而有效避免了以往的无指导分段的弊端。

在本发明的进一步实施方式中，S1中，确定适合进行退火的区域是根据退火温度确定，退火温度为60℃。需要说明的是，退火的区域可以根据需要的Tm(退火温度)决定，通常认为最佳的Tm为55℃～60℃。

在本发明的进一步实施方式中，S1中，确定适合进行退火的区域是根据Primer3、Oligo或DNAStar等工具进行确定。

在本发明的进一步实施方式中，S2中，合适长度为200～800bp，且保证各片段之间的重叠区域为适合进行退火的区域。需要说明的是，根据适合区域在片段中的位置，选择合适的长度，注意保持该长度在适合的第一步合成的片段长度范围之内，比如(200～800bp)，保证各片段之间的重叠区域为上述选择出的合适退火区，然后按照常规方法进行各个片段引物的设计。

在本发明的进一步实施方式中，在S3后，还包括S4：将拼接产物进行克隆，测序验证序列正确性。

在本发明的进一步实施方式中，S3中，重叠PCR采用Life technologies公司的Platinum Hifi聚合酶及反应体系，当然其它供应商的类似高保真聚合酶也可使用。

本发明还保护上述合成融合基因的方法在高通量测序基因诊断中融合基因标准品构建中的应用。

本发明还保护上述合成融合基因的方法在基因定量分析中融合基因的标准品构建中的应用。

本发明还保护上述合成融合基因的方法在工程抗体尤其是双特异性抗体构建中的应用。

本发明还保护上述合成融合基因的方法在多个编码序列的融合基因表达载体的构建中的应用。

本发明还保护上述合成融合基因的方法在编码序列与调控元件的融合基因的构建中的应用。

本发明还保护上述合成融合基因的方法在较长基因的合成中的应用。