[发明专利]一种植物乳杆菌来源的苯丙酮酸还原酶及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物乳杆菌来源的苯丙酮酸还原酶及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

苯乳酸(Phenyllactic acid，PLA)，又名2-羟基-3苯基丙酸，是一类非常重要的化合物，在医药及生物防腐剂等方面具有非常广泛的应用。苯乳酸具有与其衍生物丹参素(β-3，4一二羟基苯基乳酸钠)相同的药理功能，可以调节人体内的类固醇的水平和抗血小板聚集的活性。苯乳酸也是合成许多药物的重要中间物，比如：降血糖药恩格列酮(Englitazone)、非蛋白氨基酸施德丁(Statine)、抗艾滋病毒制剂、新型驱肠虫药PFl022A等。此外，近年来发现苯乳酸可作为新型的生物防腐剂，且具有非常广泛的抗菌谱，对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、单核增生性李斯特菌)、革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、沙门氏菌)和真核微生物(如曲霉青霉)等均有抑制作用。而苯乳酸生物制备法因其具有高效性、高对映选择性、高区域选择性、反应条件温和、适用范围广及环境友好等众多的优点备受研究者关注。因此，苯乳酸及其催化合成的酶类成为近年来研究的热点。

1988年，Lavermicocca等从酸面团中分离得到的L.plantarum 21B,产生的D-苯乳酸量为56mg/L,这是首次关于乳酸菌产生苯乳酸的报道。随后研究人员陆续发现不同种属的乳酸菌能够产生苯乳酸，如李兴峰等从泡菜中筛选出112株菌，其中有10株菌产生D-苯乳酸的量超过66.4mg/L。但是由于原始菌株的局限性，其产生苯乳酸的量一般都不高，且不同菌株之间有较大差异，难以达到工业产业化要求。

现有技术中，有研究者发现苯丙酮酸还原酶在催化苯丙酮酸反应12h后，苯丙酮酸的转化率为91.3％。也有研究者应用Lactobacillusplantarum CECT-221生产苯乳酸，在优化后的培养条件下，2L的发酵罐中发酵培养158h，苯乳酸产量仅为0.7g/L。由此可以看出，采用发酵法制备苯乳酸的产率较低，产物提取困难，而生物转化法制备苯乳酸的底物上载量和产率均有所提高，但是反应时间过长，仍不能达到工业化生产的要求,需要进一步开发高效还原酮酸的酶类。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种苯丙酮酸还原酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有苯丙酮酸还原活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码所述苯丙酮酸还原酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.1所示苯丙酮酸还原酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-28a(+)为载体表达所述苯丙酮酸还原酶基因。

在本发明的一种实施方案中，所述的宿主为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌按如下步骤构建：(1)将SEQ ID NO.1所示基因片段与与pUCm-T连接后转化宿主E.coli JM109，获得重组质粒命名为pUCm-T-lpppr；(2)将pUCm-T-lpppr与pET-28a(+)质粒均用Nde I和Not I进行双酶切，在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-lpppr；(3)将pET-28a(+)-lpppr转化入E.coli BL21(DE3)宿主。

本发明的第四个目的是提供所述基因的异源表达方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，于37℃、转速220rpm培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为0.4-0.6mM进行诱导，18～22℃诱导表达7～9h。