[发明专利]一种菜豆来源的环氧化物水解酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种菜豆来源的环氧化物水解酶及其应用，属于生物技术领域，。

背景技术

手性纯的环氧化物及其对应的水解产物邻二醇被认为是一类具有高附加值的多功能手性砌块，在手性药物和精细化学品的合成中应用广泛。然而，在一些手性环氧化物的制备过程中，Sharpless不对称环氧化、Jacobsen环氧化等化学法的反应结果往往无法达到期望的手性纯度，产物(指保留下来的单构型环氧化物和生成的二醇)的对映体过剩率(Enantiomeric excess,ee)值通常只有30％～80％，而且所使用的重金属等催化剂也给环境带来巨大的威胁。近年来，生物酶所介导的动力学拆分和对映体归一性水解法因其较为专一的立体选择性而逐渐走进人们的视野，环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase,EH,EC 3.3.2.x)就是其中一类重要的酶，该酶可以催化环氧化物的开环水解，使水分子立体选择性地加成到环氧化物的含氧三元环上，生成相应的1,2-二醇，是一种典型的α/β折叠型水解酶。EH来源广泛、反应无需辅因子、底物谱广、反应条件温和，被认为是一种颇具开发潜力和研究价值的生物催化剂。

目前，人们已经从动物、植物和微生物中发现了300多种EH，并根据酶的亚细胞定位及底物的特异性将其划分为七个亚家族，其中可溶性环氧化物酶是当前研究较多的EH之一。Bellucci等研究了存在于哺乳动物体内微粒体环氧化物水解酶的立体化学特性，利用其催化水解一些β烷基取代的环氧苯乙烷衍生物，结果得到对应的R型二醇。胡蝶等从宇佐美曲霉中成功发掘出一种新型的环氧化物水解酶AuEH2，发现其对R型环氧苯乙烷(Styrene oxide,SO)的亲和性较S型的高，认为该酶在外消旋(rac-)SO的手性拆分反应中具有很大的应用潜力。较之上述几种来源，植物EH则更加容易获得且原料也较为廉价。当前已经在包括大豆(Glycine max)、木豆(Cajanus cajan)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)等植物基因组中确定了编码EH的开放阅读框，其中研究最深入的是马铃薯EH，其晶体结构早在2006年就已通过X射线衍射图谱的解析获得。最近，许建和课题组从绿豆(Vigna radiata)中发现的两种EH(MbEHA,MbEHB)在以对硝基环氧苯乙烷为底物的情况下表现出互补的对映选择性，引起了相关学者的关注。

迄今报道的环氧化物水解酶虽然均具有一定的不对称水解环氧化物的活性，但是目前仅有40余种EH针对于一种或多种环氧化物表现出高的对映选择性(即对映选择率E值>30)，据我们所知，除国外学者研究的马铃薯EH之外，目前尚无植物来源的EH可以高效的拆分rac-SO制备高手性纯的R-SO，因此，通过分子生物学手段挖掘能够表达具有高选择性的EH基因构建其表达体系，并将其应用于光学纯环氧化物的制备等研究工作具有着重要经济和社会效益。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种环氧化物水解酶PvEH2，如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述环氧化物水解酶PvEH2的基因，基因命名为pveh2，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列全长951bp，编码316个氨基酸。

本发明的第三个目的是提供一种用于生产R-环氧苯乙烷的重组大肠杆菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.2所示的环氧化物水解酶。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET-28a(+)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌是按如下方法构建的：(1)扩增SEQ ID NO.1所示序列，在基因两端引入限制性内切酶Nde I和Xho I的酶切位点；(2)用上述两种内切酶分别处理SEQ ID NO.1所示序列和表达载体pET-28a(+)，并将上述酶解消化产物在17℃连接过夜，得到重组表达质粒pET-28a(+)-pveh2；(3)将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，即可得到重组菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-pveh2。