[发明专利]金银花克隆LjHQT基因、克隆方法、植物表达载体及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种金银花克隆LjHQT基因。属于基因克隆技术领域。

背景技术

HQT基因产物是绿原酸生物合成途径中的关键酶之一。2008年，Rommens等对马铃薯块茎特异表达经过修改的MYB转录因子基因StMtf1M，激活了苯丙醇生物合成途径，使绿原酸的含量大幅提高，并同时检测到奎尼酸-羟肉桂酰基转移酶基因(HQT)的表达显著上升。Carla Clé等将番茄在温室内培养，并对其HQT基因进行表达调控，HQT高表达的番茄叶绿原酸含量最高，而野生型次之，HQT基因沉默的番茄叶绿原酸含量最低。他们发现HQT高表达的番茄叶绿原酸含量是野生型的2.5倍，并最终得出了HQT对番茄叶中绿原酸含量的积累起到关键作用的结论，这也与Niggeweg等的结论一致。再一次证实了HQT的表达量与番茄中绿原酸的含量直接相关。

综上所述，金银花中高含量的绿原酸及其同属植物中HQT的发现，以及HQT与多种植物绿原酸的生物合成密切相关，HQT表达量的增减往往伴随着绿原酸含量的升降这一事实，预示着金银花植物体内极有可能存在HQT基因的表达，并且它与金银花中绿原酸的积累密切相关。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种金银花克隆LjHQT基因。

本发明还提供了上述基因的克隆方法，利用上述基因构建的植物表达载体。

本发明还提供了上述基因的用途。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

金银花克隆LjHQT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取金银花RNA，反转录获得cDNA；

(2)参照其他植物HQT保守区设计简并引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增，获得核心序列；简并引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

(3)通过RACE方法从核心序列克隆全长cDNA序列，即为LjHQT基因。

简并引物的序列如下：

P1：5'-GACTHTGCYTAARGHTNGC-3'，如SEQ ID NO.3所示；

P2：5'-CACHCCAATCAHTCCYTCNCCNGt-3'，如SEQ ID NO.4所示；

其中，N代表任意一种核苷酸；R代表A或G；Y代表C或T；H代表A或C或T。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，RNA的提取对象为金银花幼叶片。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，所述其他植物为马铃薯、番茄、烟草或咖啡。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)中PCR扩增使用Ex Taq酶，扩增程序如下：95℃变性4分钟后，依次进行94℃30秒、55℃40秒、72℃90秒30个循环，最后于72℃延伸15分钟。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)中所得核心序列为860bp。

作为优选的技术方案之一，步骤(3)所得LjHQT基因全长1,621bp，其中包括1,320bp的编码区、209bp的5’非翻译区和一个包含18个多聚腺苷酸尾的92bp 3’非翻译区，与其他植物HQT的同源性介于42～71％之间。

一种利用上述基因构建的植物表达载体。

作为优选的技术方案之一，所述植物表达载体是利用Gateway技术构建得到的。

上述基因的用途，利用上述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗病性转基因植物。

本发明的有益效果：

本发明从金银花中克隆酰基转移酶基因LjHQT，与其他植物HQT的同源性介于42～71％之间。经试验验证，LjHQT对奎尼酸的亲和力更高。在香豆酰辅酶A饱和时，LjHQT对奎尼酸的亲和力(Km＝77±45μmol/L)比莽草酸(Km＝5579±371μmol/L)高70倍。LjHQT能显著提高转基因株系中绿原酸含量，有效提高转基因植株的抗病性。

附图说明

图1是金银花LjHQT与其他植物HQT的序列比对(CAE46932，烟草；ABK79689，刺棘蓟；ABO77956，咖啡；AEK80405，金银花)；

图2是LjHQT系统发育分析；

图3是LjHQT的Southern blot杂交分析；

图4A～图4C是LjHQT原核表达载体的构建及分子检测；

图5是SDS-PAGE分析金银花LjHQT诱导表达及纯化回收情况；