[发明专利]一种PCR扩增冻干预存试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体来说是一种PCR扩增冻干预存试剂及其制备方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，具有快速、简便、灵敏、特异的优点,PCR技术广泛应用于基因克隆、突变检测和疾病筛查，为科学研究及临床诊断方面带来了革命性的进展。

DNA扩增是一段特定的DNA序列拷贝数增加的过程，可发生在体内或体外,体外扩增可通过聚合酶链反应获得，DNA模板和引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，以目标DNA序列为模板，按5’→3’方向，根据碱基配对和半保留复制原则，经过多次循环的变性-退火-延伸的过程，将目标DNA片段进行几百万倍的复制扩增,DNA的扩增优点是特异性高、灵敏度高、成本低廉、操作简单、设备要求简单。

RNA扩增即逆转录PCR，是将RNA的反转率(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术,以RNA为模板经过反转录酶的作用从RNA合成cDNA后，再以cDNA为模板，经过PCR反应，对目标RNA进行复制扩增,通过将发反转录和PCR技术项结合，实现了RNA的复制和扩增，操作简单、扩增效率高、灵敏度高、特异性强。

核酸诊断是用分子生物学的理论和技术，通过直接探查核酸的存在状态或缺陷，从核酸结构、复制、转录或翻译水平分析核酸的功能，从而对人体状态与疾病作出诊断的方法,核酸诊断是通过互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交,这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它既能在DNA和DNA之间进行也能够在DNA和RNA之间进行,用一段已知的序列作为探针，与单链DNA结合，两者碱基能够完全配对，即为互补结合，则说明待测DNA中含有已知序列,核酸诊断广泛用于各种病原体检测，但是运输不便，操作复杂，对实验者技术要求较高，污染的可能性大，目前市场缺少能在4℃或常温保存的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的运输不便、操作复杂、存在污染性的缺陷，而提供一种PCR扩增冻干预存试剂及其制备方法。

本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种PCR扩增冻干预存试剂，包括以下组分：DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、低温冻干保护剂。

作为优选，所述的DNA聚合酶的浓度为0.05U/ul，所述的Mg2+的浓度为4mM，所述的dNTP的浓度为0.4mM，所述的低温冻干保护剂的浓度为1.2-7mM。

作为优选，所述的低温冻干保护剂由以下组分组成：海藻糖4-25g、甘露糖醇1-7g、牛血清白蛋白1-7g、吐温0.1-0.25ml、Tris-HCl 2.5-5.0mmol、水49-50ml。

作为优选，本发明还公开了上述PCR扩增冻干预存试剂的制备方法,具体步骤如下：

一、将DNA聚合酶、Mg2+、dNTP混合在一起，制备得到PCR反应体系混合液，再将PCR反应体系混合液与低温冻干保护剂混合均匀；

二、将混匀后的液体放入冷冻干燥箱中，进行预冻3-5h；

三、在-45℃—-55℃的条件下，进一步升华，保持冷冻干燥2-4h；

四、重复步骤三两次，得到最终的PCR扩增冻干预存试剂；

五、将PCR扩增冻干预存试剂分装进96孔板反应管中，使用时加ddH₂O稀释即可。

作为优选，所述的步骤二中，冷冻温度为-45℃—-55℃。

作为优选，步骤一中PCR反应体系混合液和低温冻干保护剂按照使用浓度比例为3.3-7.0：12.8-16.5。

作为优选，步骤五中96孔板中的每个反应管使用时总反应体积为20μl。

与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：

本发明提供了一种用于核酸扩增的预装96孔PCR反应管，具体包括：DNA聚合酶，缓冲液，Mg2+，dNTPs和低温冻干保护剂(海藻糖、甘露糖醇、牛血清白蛋白、吐温、Tris-HCl、水)以及分装使用的96孔PCR反应管，本发明提供的PCR扩增冻干预存试剂，使核酸扩增试剂冷冻干燥后能在常温条件下运输，历时3天，对检测效果没影响，节约运输成本；易于保存：冻干体系无需低温冷冻，可于4℃保存6个月，若于-20℃可保存1年；操作容易，检测效果好：使用时仅需加入缓冲剂复溶，再加入待检测的模板，即可进行检测，且灵敏度无损失或损失很小；保护剂组分简单，成本低廉。

具体实施方式