[发明专利]一种表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体，所述载体在pMD19T-Simple载体TA克隆位点插入含有鸡痘病毒的早晚期启动子LP2EP2启动下的DADV2fiber2基因、P11启动子启动下的lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段LTYB、RTYB，载体序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)构建含同源重组臂基因质粒pMD-TYB：以鸡痘病毒的核酸作为为模板，使用引物LTYB-F/R、RTYB-F/R分别扩增左右同源臂序列，先将扩增的左同源臂序列TA克隆至pMD19T-Simple载体，得到质粒pMD-LTYB，再将扩增的右同源臂序列插入到NotI和EcoRI位点间，得到含有左右同源重组臂的质粒pMD-TYB；

(2)构建质粒pMD22：合成含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2、P11启动子的多克隆位点序列，并通过TA克隆至pMD19T-Simple载体中，形成质粒pMD22；

(3)构建质粒pMD22-lacz：以质粒pSV-β-Galactosidase Control Vector为模板，使用引物lacz-F/R扩增lacz序列，使用infusion酶将扩增产物插入(2)中所得质粒pMD22的XhoI位点，形成质粒pMD22-lacz；

(4)构建中间载体pMD22-TYB-lacz：将(3)中所得质粒pMD22-lacz、(1)中所得质粒pMD-TYB用NotI酶切连接，形成含有左右同源臂、鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2的多克隆位点、P11启动下lacz基因的中间转移载体pMD22-TYB-lacz；

(5)构建转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2：以鸭2型腺病毒为模板，以D-FB2-F/D-FB2-R为引物，扩增得到DADV2 fiber2基因；将扩增产物DADV2fiber2基因插入(4)中所得质粒pMD22-TYB-lacz的SmaI位点，形成含鸭2型腺病毒fiber2基因的转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2；

(6)对(5)中所得转移载体pMD22-TYB-lacz-DFB2进行效果验证。

3.根据权利要求1所述表达鸭2型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体在制备FPV载体疫苗中的应用。

4.一种抗鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体的FPV载体疫苗的制备方法，包括步骤：

将权利要求1所述的重组鸡痘病毒转移载体接种于铺满单层的CEF细胞上，于37℃，5％CO₂培养箱孵育2h后继续进行蓝白斑筛选纯化，如此反复进行十代的纯化，直至所有病变出现的空斑均为蓝斑，则纯化完成；将纯化好的病毒液再接种于CEF细胞上进行传十代，收集病毒液，用其生产得抗鸭2型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗。