[发明专利]多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于荧光定量PCR领域，具体涉及一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒。

背景技术

幽门螺旋杆菌( HP) 感染是一个全球性的问题，全世界人群感染率为50%。它与慢性胃炎、 消化性溃疡及胃腺癌等消化道疾病的发生、 发展密切相关，根除 HP 是防治上述疾病的重要环节。在中国、欧洲等多个针对HP处理的共识意见中，均推荐含PPI和两种抗生素(阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑中的两种)的三联疗法作为根除HP治疗的一线方案。随着HP根除治疗的普及和推广，越来越多的患者在接受首次治疗后HP不能被根除。有多种因素可能导致三联疗法治疗失败，HP对抗生素耐药是导致根除失败的主要原因。

HP对抗生素耐药的问题在全球均比较普遍。Megraud报道，1990～2002年全球HP对甲硝唑的原发耐药率，日本最低，为9％～12.4％，墨西哥最高，为76.3％。其他多数国家和地区为20％~40％；HP对克拉霉素的原发耐药率，英国和德国最低，为4％，墨西哥最高，为25％；HP对阿莫西林的耐药情况多数地区报道为0，伊拉克最高，为0.9％，英国为0.4％。近年HP对抗生素的耐药问题呈现出日益严重的趋势。一项意大利的研究显示，在过去15年内，HP对克拉霉素的耐药率增加了1倍，从1989～1990年的10.2％增加至2004～2005年的21.3％。香港地区HP对甲硝唑和克拉霉素的耐药率从1997～2001年的29％和4.5％分别上升至39％和7.8％。北京地区HP对甲硝唑和克拉霉素的耐药率分别从1999~2000年的36％和10％上升至2001~2002年的43％和18％，但几年间仅发现l株阿莫西林耐药菌株。本研究结果显示，在中国地区，HP对甲硝唑耐药已非常普遍，平均耐药率为75.6％，对克拉霉素的耐药率也已达27.6％，且85.1％对克拉霉素耐药的菌株同时对甲硝唑耐药，说明在中国地区，HP对甲硝唑和克拉霉素耐药的问题已相当严重，但HP对阿莫西林耐药并不常见，其平均耐药率为2.7％。

甲硝唑价格便宜，在胃内具有高稳定性和高活性，多年来一直被作为HP根除治疗的主要药物之一，在妇科疾病和口腔疾病的治疗中甲硝唑也被广泛应用，这可能是导致HP对甲硝唑耐药率迅速增加的原因之一。克拉霉素被认为是HP根除治疗方案中最有效的抗生素，由于其价格较高，几年前在中国并不常用于HP的根除治疗。随着中国经济的发展和人民生活水平的提高，克拉霉素在临床上的应用也越来越广泛，不但被用于HP的根除治疗，在其他感染性疾病中也被广泛应用，从而导致HP对克拉霉素的耐药率增加；此外，其他大环内酯类药物如红霉素、阿奇霉素等与克拉霉素存在交叉耐药。前者的广泛应用也是导致HP对克拉霉素耐药的原因之一。尽管阿莫西林在临床的应用也非常广泛，但是在世界各地，HP对阿莫西林的耐药率均较低，这可能与HP对阿莫西林耐药的特殊机制有关，HP并非通过产生β-内酰胺酶而对阿莫西林耐药。

目前，临床上用于幽门螺旋杆菌耐药检测的方法主要有药敏实验，PCR-测序法，实时荧光PCR法。（1）PCR-测序法：此方法为在PCR结束后将PCR产物进行测序，从测序结果判断突变情况，测序法操作复杂、检测周期长、成本较高。（2）药敏实验：此方法为取得样本后，先进行培养，然后再进行药敏实验，步骤复杂、耗时长。（3）实时荧光PCR法：实时荧光PCR法只需一步扩增，无需后续操作就能得到耐药基因突变结果，灵敏度高、特异性好，操作简单且易于实现自动化检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本试剂盒能对胃黏膜组织样本中的幽门螺旋杆菌耐药基因突变进行检测，判断其是否存在耐药性。包含的药物及耐药基因突变位点为：克拉霉素（2142A>G、2143A>G、2182C>T），四环素（926-928AGA>TTC），奎诺酮类（Asn87-Lys；Ala88-Val；Asp91-Gly），阿莫西林（S414R、Y484C、T541I和P600T）。本发明所述试剂盒能够在短时间内得到准确的结果，适用于临床上幽门螺旋杆菌个体化用药的指导。

试剂盒共包含7个组分：克拉霉素耐药反应缓冲液，四环素耐药反应缓冲液，奎诺酮类耐药反应缓冲液，阿莫西林耐药反应缓冲液，酶混合液，阳性对照，阴性对照，

克拉霉素耐药反应缓冲液包含CLW上游引物、CLW探针、2142下游引物、2143下游引物、2182下游引物、内控引物及探针、dNTPs、MgCl₂、KCl；