[发明专利]猪流行性腹泻病毒荧光RPA检测方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了用于RPA技术快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)中的M基因的引物、探针组合及检测方法。正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明所建立的RPA方法可在39℃恒温反应20min，可实现对PEDV的有效检测，以包含PEDV病毒M基因片段的puc57质粒为模板，RPA检测限为10¹拷贝；RPA仅特异性扩增PEDV病毒M基因，对TGEV，PRRSV，PCV‑2以及CSF病毒的膜蛋白或核衣壳蛋白基因序列没有扩增。而且，应用该RPA方法可有效检测出血浆及血浆蛋白粉中的PEDV核酸。本发明所建立的RPA方法操作简单，反应快速，检测准确，灵敏度高，为PEDV的检测防控提供了一种新的、可靠的技术支持。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及用于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)技术快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)中的M基因成分。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒科(Coronaviridae)的猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水为主要特征的高毒接触性肠道传染病，可导致未断乳仔猪大量死亡，造成重大经济损失^[1-2]。PEDV为单股正链RNA病毒，有囊膜，病毒粒子直径约120nm，病毒基因组具有5’端的帽子结构和3’端的Poly(A)尾巴。其主要基因包括非结构蛋白编码区、S基因、ORF3、 E基因、M基因、N基因等^[3-4]。有研究表明，该疫病的爆发可能与携带PEDV的血浆蛋白粉饲料有关^[6-7]。PEDV的快速准确检测对于PED 的防控至关重要。

等温核酸扩增(isothermal amplification)技术于20世纪90年代初出现，其理念是在恒定温度下，通过特殊的蛋白(酶)使得DNA双链解旋，并促使特异性DNA片段扩增，以达到核酸体外扩增的效果^[8]。因等温核酸体外扩增不需要高温变性、退火和延伸的环节，核酸扩增变得更加迅速和高效。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)，该技术是一种在常温下可以使核酸快速扩增的方法^[9]。在25～42℃范围内的等温条件下，重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single stranded protein，SSP) 的作用下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，结合荧光探针，恒温条件下20到30min即可获得检测结果^[10]。目前，RPA技术已经在一系列的病原微生物分子检测中得到应用，包括口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒以及结核分枝杆菌等^[11-13]。但是，未见RPA技术在PEDV检测中的应用。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是建立一种以 PEDV病毒M基因序列为靶标的荧光RPA检测方法，测试了其灵敏度和特异性，并成功检测了血浆和血浆蛋白粉中PEDV核酸。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种用于通过重组酶聚合酶扩增技术检测猪流行性腹泻病毒M基因的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ IDNo.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

本发明在具体实施方式中所使用的相应引物及探针均由华大基因(北京)合成。

本发明还提供了一种检测猪流行性腹泻病毒M基因的试剂盒，该试剂盒包含前述引物和探针组合。